水飞蓟素、菊粉和β-葡聚糖对缓解凡纳滨对虾低盐应激的效应研究

发布时间：2020-03-31 11:55

【摘要】：凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),旧称南美白对虾,因其广盐性特征,近年淡化养殖发展迅猛。凡纳滨对虾淡化养殖中,水体盐度大多低于5‰,该盐度对对虾而言是种胁迫,直接影响凡纳滨对虾的渗透压调节和能量代谢,进而影响机体生长和健康,而对虾机体健康与肝肠健康密切相关。本文以低盐度3‰作为胁迫因子,以凡纳滨对虾体液等渗点盐度25‰作为对照,研究低盐胁迫对凡纳滨对虾肝肠的影响,并选择3种功能物质作为添加剂,探究营养调控对缓解凡纳滨对虾低盐应激的效果和机制。主要结果如下:1、低盐度胁迫对凡纳滨对虾肝肠健康的影响为探究低盐度胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺和肠道的影响,选取虾苗(0.080±0.003 g)分别以25‰盐度和3‰盐度养殖8周。结果显示:生长上,3‰盐度下对虾的增重率下降,饵料系数上升,全虾灰分下降(P0.05)。低盐胁迫对凡纳滨对虾的肝胰腺和肠道造成了明显的氧化损伤,肝胰腺和肠道中丙二醛含量显著上升,且肠道中还原型谷胱甘肽含量显著下降(P0.05)。同时,低盐胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺消化酶活性有升高趋势,而肠道消化酶有下降趋势。与25‰盐度相比,3‰盐度下对虾肝胰腺中酸性磷酸酶活性显著上升,酚氧化酶活性显著下降,肠道中溶菌酶活性显著下降(P0.05)。与对照组25‰盐度相比,3‰盐度养殖的凡纳滨对虾肝胰腺中分泌细胞数量增多且体积增大,吸收细胞数量减少,肝小管排列疏松,基底膜略有破损;肠道肌肉层变薄且绒毛变短,上皮细胞游离面有部分微绒毛脱落。肠道菌群分析表明,在门水平,低盐胁迫下凡纳滨对虾肠道中的的Saccharibacteria、绿弯菌(Chloroflexi)和Gracilibacteria显著上升;在属水平,低盐组对虾肠道中假单胞菌(Pseudomonas)、黄杆菌(Flavobacterium)和希瓦氏菌(Shewanella)等潜在致病菌明显增多(P0.05),增加了低盐度下对虾爆发疾病的可能。肠道菌群16S功能预测分析表明,与25‰盐度相比,低盐胁迫下对虾肠道菌群的KEGG pathway丰度在三个等级的多个代谢通路均有显著变化,包括氨基酸代谢、能量代谢、脂代谢和多糖合成、消化代谢和免疫系统通路丰度明显下降,而分泌系统、细菌趋药性、无机离子运输和代谢、蛋白激酶等通路丰度明显富集(P0.05)。本研究表明,极低盐度3‰胁迫下,凡纳滨对虾肝胰腺会发生适应性变化,但低盐度仍会对肝胰腺和肠道结构造成损伤,继而造成生长性能和免疫酶活的下降,这些变化可能与肠道菌群的代谢功能变化密切相关。而低盐度下,凡纳滨对虾肠道中致病菌丰度的升高增加了疾病爆发的可能。2、功能性添加剂水飞蓟素缓解凡纳滨对虾低盐应激的效应研究为探究水飞蓟素缓解凡纳滨对虾低盐应激的效应,设计水飞蓟素添加量分别为0(对照组)、0.01%、0.02%和0.04%的四组饲料,选取虾苗(0.080±0.003g)以3‰盐度的水体养殖8周,结果显示:饲料中添加水飞蓟素(0.01%~0.04%)后,凡纳滨对虾的增重率显著上升,饵料系数显著下降(P0.05)。0.04%水飞蓟素添加组对虾的肝胰腺淀粉酶活性显著上升,0.02%和0.04%水飞蓟素添加组对虾的肠道蛋白酶和淀粉酶活性显著上升(P0.05)。饲料中添加0.04%水飞蓟素能显著提高凡纳滨对虾肝胰腺中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性,同时提高还原型谷胱甘肽含量(P0.05)。0.02%水飞蓟素能显著提高肠道中酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性(P0.05)。饲料中添加水飞蓟素后,肝胰腺基底膜完整,肝小管排列紧密,分泌细胞和吸收细胞数量增多。饲料中添加0.02%和0.04%水飞蓟素能显著增加凡纳滨对虾肠道绒毛的长度。比较对照组和0.04%水飞蓟素添加组凡纳滨对虾的肠道菌群,发现0.04%水飞蓟素添加组对虾的肠道Gracilibacteria丰度(门水平)显著下降,在属水平,Iamia、土微菌(Pedomicrobium)、生丝微菌(Hyphomicrobium)、红球菌(Rhodococcus)、申氏杆菌(Shinella)、不动杆菌(Acinetobacter)、军团杆菌(Legionella)、迪茨菌(Dietzia)丰度显著升高(P0.05),但肠道细菌代谢通路丰度无显著变化。本研究表明,0.01~0.04%的水飞蓟素均能有效降低凡纳滨对虾的肝肠氧化损伤,提高生长性能,但水飞蓟素对肠道菌群影响有限,对肠道细菌代谢通路丰度无显著影响。3、功能性添加剂菊粉缓解凡纳滨对虾低盐应激的效应研究为探究菊粉缓解凡纳滨对虾低盐应激的效应,设计菊粉添加量分别为0(对照组)、0.1%、0.2%和0.4%的饲料,选取虾苗(0.020±0.005 g)以低盐度3‰养殖8周。结果发现,与对照组相比,饲料中添加0.2%和0.4%菊粉能显著提高对虾的增重率,添加0.4%菊粉全虾灰分显著升高(P0.05)。同时,0.2%和0.4%的菊粉能有效提高肠道绒毛长度和凸起数量,0.4%的菊粉能显著提高肠道的淀粉酶活性(P0.05)。0.2%和0.4%菊粉能显著提高肝胰腺的抗氧化水平和酸性磷酸酶活性,而且0.4%菊粉能显著提高酚氧化酶含量(P0.05)。比较对照组和0.4%菊粉添加组对虾的肠道菌群,在门水平,0.4%菊粉添加组对虾肠道的厚壁菌(Firmicutes)和蓝藻(Cyanobacteria)显著高于对照组,浮霉菌(Planctomycetes)显著低于对照组(P0.05)。低盐胁迫下,饲料中添加0.4%菊粉能显著降低肠道中假单胞菌(Pseudomonas)和纤维弧菌(Cellvibrio)的丰度,这降低了对虾疾病爆发的风险。同时,包括芽孢杆菌(Bacillus)、土芽孢杆菌(Geobacillus)、链球菌(Streptococcus)和乳球菌(Lactococcus)在内的多种益生菌丰度显著上升(P0.05)。本研究表明,菊粉(0.2%~0.4%)能有效提高肝胰腺和肠道消化酶活力,增强机体抗氧化能力,而这些作用可能与肠道内多种益生菌丰度的上升有关。4、功能性添加物β-葡聚糖缓解凡纳滨对虾低盐应激效应的研究探究β-葡聚糖缓解凡纳滨对虾低盐应激效应的作用,设计β-葡聚糖添加量分别为0(对照组)、0.01%、0.02%和0.04%的饲料,选取虾苗(0.020±0.005 g)以低盐度3‰养殖8周。结果发现,0.02%和0.04%添加组的对虾增重率显著升高,饵料系数显著下降(P0.05);0.04%组对虾的肥满度显著高于对照组(P0.05)。0.02%添加组对虾肝胰腺的淀粉酶活力显著高于对照组(P0.05);肠道蛋白酶和淀粉酶活力均随β-葡聚糖添加量的增加而升高。在肝胰腺中,丙二醛含量随β-葡聚糖添加量的增加而降低;过氧化氢酶活力和超氧化物歧化酶活力均随β-葡聚糖添加量的增加而增加,且0.02%和0.04%添加组的超氧化物歧化酶活力显著高于对照组(P0.05);0.02%和0.04%的β-葡聚糖添加量都能显著提高对虾谷胱甘肽过氧化物酶和酚氧化酶的活力(P0.05)。检测6种基因(Toll样受体、IMD、Hsp70、MSTN、TNF-α、CTL3)在肝胰腺和肠道中的表达情况。随着β-葡聚糖添加量的增加,在两种组织中Toll样受体、MSTN的mRNA表达量均升高,TNF-α、CTL3的mRNA表达量均降低,IMD和Hsp70的mRNA表达量分别在肠道和肝胰腺中升高。综上,与25‰盐度相比,极低盐度3‰会对凡纳滨对虾肝胰腺和肠道显微结构造成损伤,同时氧化损伤加重,机体免疫力下降。低盐度3‰的8周养殖实验表明,饲料中添加适量水飞蓟素(0.01%~0.04%)、菊粉(0.2%~0.4%)、β-葡聚糖(0.02%~0.04%)能有效缓解低盐应激对凡纳滨对虾造成的负面影响,改善对虾生长性能。
【图文】：

处理组,肝胰腺,T-2毒素,组织切片

图 1 T-2 凡纳滨对虾肝胰腺对照组和 T-2 毒素处理组的组织切片观察[46]对照组，BL 表示基底膜，LU 星形管腔；II：0.5mg/kg T 2 毒素处理组，*标示 B 细胞数显著增加；III：1.2 mg/kg T 2 毒素处理组，*标示液泡，ALU 表示不正常的基底膜，NU示细胞核变暗；IV：2.4mg/kgT 2 毒素处理组，*标示液泡，NU 表示受损细胞核；V：4.8/kgT 2 毒素处理组，NU 表示细胞核破裂；VI:12.2mg/kgT 2 毒素处理组，基底膜溶解，，胞坏死。ate I) Control shrimp. The basal lamina (BL) is clearly seen, an indication of cellular integrity.fferent hepatopancreas cellular types were clearly visible: B cell = vacuolated cells, R cell =orptive cells; LU = lumen. (plate II) Shrimp fed 0.5 mg/kg T 2 in the diet. Increased number ofcells and slight vacuolization (asterisk [*]). (plate III) Shrimp fed 1.2 mg/kg T 2. Markeduolization (*) and abnormal lumen (ALU) were observed and the cell nucleus (NU) was darker.ate IV) Shrimp fed 2.4 mg/kg T 2. Marked vacuolization (*), abnormal lumen (ALU), andcleus (NU) damage were observed. (plate V) Shrimp fed 4.8 mg/kg T 2. Vacuolization in cells,s of cells, and nucleus (NU) fragmentation were observed. (plate VI): Shrimp fed 12.2 mg/kg T Large vacuoles probably due to fusion of small vacuoles, dissolved lumen and cytoplasmicative of necrosis, and lysis (autophagy) were observed.All plates, 400× (bar = 10×).

对比图,对比图,肝胰腺,对虾

（4）疾病肝胰腺是对虾重要的组织器官之一，当机体感染细菌病或病毒病后，肝胰腺就会受损。对虾急性肝胰腺坏死综合症（actuehepatopancreasnecrosissyndrome，AHPNS）曾被称为早期死亡综合症(early mortality syndrome, EMS)，对虾感染该病后，肝胰腺明显萎缩，呈白色或灰色，有时会见黑点或黑色条纹，组织发生纤维化病变[51]。组织切片显示肝胰腺盲管上皮细胞坏死，细胞核肿大，B 细胞、F细胞和 R 细胞功能紊乱，E 细胞有死分裂能力显著降低，在后期肝胰腺盲管内和盲管间发生血细胞浸润，并出现继发性细菌感染[52,53]。当凡纳滨对虾患白便综合症后，对虾的肝胰腺会萎缩、肿大、增生、坏死，乃至崩解[54]。能够造成凡纳滨对虾肝胰腺组织损伤的细菌和病毒有多种，如白斑综合症病毒、对虾杆状病毒、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌等，这些病菌多会造成肝胰腺的肿大、消解、变黑和坏死[55,56]。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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