重组草鱼干扰素对鲫鱼的免疫保护

发布时间：2020-04-18 17:07

【摘要】：I型干扰素是先天性免疫应答的一类重要的细胞因子,在抗病毒和抗癌中都有广泛地效用。鲫鱼与草鱼的I型干扰素有很高的同源性。在我们先前的实验中,重组草鱼干扰素的免疫保护作用以及抗病毒功能已经在草鱼细胞和组织中得到了验证。为了探究重组草鱼干扰素对鲫鱼的免疫保护作用以及它的作用机制,我们用poly I:C建立了一个病毒感染鲫鱼模型,然后用重组草鱼干扰素进行免疫保护实验。在本实验中,我们构建了pBV220-CiIFN重组质粒并且用大肠杆菌BL21(DE3)pLys S作为表达重组草鱼干扰素的宿主菌。采用原核表达的方法42℃诱导4 h获得大量的rCiIFN蛋白,进一步通过切胶回收的方法得到纯化的蛋白。最后经过SDS-PAGE检测纯化后的r CiIFN大小约为21kDa,蛋白浓度测定试剂盒测出浓度为330μg/ml。将蛋白稀释到合适浓度,为了评估在poly I:C下r CiIFN对鲫鱼体内的保护效果,我们采用口服的方法免疫鲫鱼。在给鲫鱼腹腔注射poly I:C之前,分别连续投喂1d、2d和3d拌有rCiIFN蛋白的饲料,并确保每克鱼体重能摄入1μg的重组蛋白。结果表明,与对照组的鲫鱼相比,口服免疫的方法确实能对鲫鱼起到更好的保护效果,其中连续投喂3d的鲫鱼相对存活率是54.29%,要高于连续投喂2d和1d的存活率,连续投喂2d和1d的鲫鱼存活率分别是47.83%和38.81%。然而对照组的存活率与实验组的相比则低得多,投喂了1d、2d和3d的存活率分别为16.25%、13.75%和12.50%。为进一步了解重组草鱼干扰素对鲫鱼免疫保护的分子机理,我们通过实时荧光定量PCR的方法分析rCiIFN对PKR以及IFN的诱导表达效果。在鲫鱼腹腔注射rCiIFN蛋白的24h、48h、72h以及对照组腹腔注射PBS后分别提取鲫鱼肝、肠、心、肾、鳃五个组织的总RNA,之后反转得到其cDNA。采用实时荧光定量PCR的方法检测鲫鱼五个组织中IFN以及PKR的表达情况。通过与对照组相应组织中IFN以及PKR的表达量相比,实验组腹腔注射了r CiIFN的所有的组织中的IFN以及PKR的表达量都有上调趋势,IFN以及PKR大都在48 h或72 h之后的表达量达到最高。这些结果表明当鲫鱼在poly I:C刺激下重组干扰素具有抗病毒活性并且采用rCiIFN拌料投喂的方式免疫鲫鱼能使其有保护作用。
【图文】：

质粒图谱,原核生物,重新构建,蛋白基因

重组质粒的构建FN)基因的特异扩增室先前构建好的重组草鱼干扰 iIFN，重新构建 pBV220-CiIFN 重组质粒SD sequence (用于结合原核生物核糖体的入带起始 ATG 的外源基因，可表达非融止出现“通读”现象，有利于质粒-宿主系利于增加其拷贝数及容量。因其含有 PL用而又对温度敏感的 cl 蛋白基因 clts857 中的外源基因的转录进行调控。pBV220 载体，，能够在 42 ℃表达非融合的目的蛋

特异性引物,基因,鱼干,第三

第三章结果和分析第三章结果与分析重组质粒的构建)基因的特异性扩增及其纯化的重组草鱼干扰素表达菌株 B鱼干扰素基因片段，利用草鱼扩增。通过 1 %琼脂糖凝胶电泳大小符合预期片段大小，之后用产物并进行琼脂糖凝胶电泳检测
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S943

【相似文献】