中华绒螯蟹卵黄蛋白原（Es-vtg1）及其受体（Es-vgr）的表达模式与Es-vtg1抗菌功能研究

发布时间：2020-04-18 16:43

【摘要】：生殖生物学是水产经济动物养殖的重要基础学科之一,是人工繁育的重要基础,而性腺发育与免疫防御机理又是生殖与免疫研究领域的热点问题。中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国重要的水产经济甲壳动物,本论文以该蟹卵黄蛋白原为切入点,探讨了卵黄蛋白原及其受体的表达模式与抗菌机制。本实验首先克隆获得了中华绒螯蟹卵黄蛋白原基因(Es-vtg1)的cDNA全序列,该基因全长7939 bp,ORF区包含2567个氨基酸。生物信息学分析发现,该基因包含三个结构功能域:LPD_N结构域、DUF1943结构域及VWD结构域。序列比对显示,Es-vtg1的结构在甲壳动物中是高度保守的。实时定量PCR和Western Blot显示Es-vtg1主要表达在卵巢、肝胰腺以及血淋巴中,其他组织也有少量表达;血淋巴免疫荧光实验显示,血淋巴中的Es-vtg1主要表达于细胞质,而卵巢组织则主要表达于细胞核内,且在发育期间随着卵巢的发育进行快速的积累。另外,本实验克隆获得了卵黄蛋白原受体(Es-vgr)的cDNA部分序列,荧光实时定量PCR和Western Blot结果显示,Es-vgr仅在中华绒螯蟹卵巢组织中特异性表达,暗示Es-vgr参与了卵巢发育过程;同时也发现,随着卵巢的发育Es-vgr表达量逐渐升高,在卵巢发育后期表达量又有所下降。而Es-vtg1的表达趋势与Es-vgr类似,暗示Es-vtg1与Es-vgr共同参与了调控卵巢发育过程。体外干扰中华绒螯蟹卵巢组织Es-vtg1后,利用实时荧光定量PCR检测到Es-vgr的表达量显著下降,这一研究结果暗示了Es-vtg1一定程度可以调控Es-vgr的表达。最后,本实验利用了金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌对中华绒螯蟹体外培养的血淋巴进行了48 h的攻毒实验,发现Es-vtg1在mRNA水平上的表达量显著上升(P0.01),而菌结合实验也证实Es-vtg1能够广泛性地结合革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌,且含有VWD结构域的原核表达蛋白能够抑制菌的生长。在此基础上,进一步通过体外干扰中华绒螯蟹血淋巴Es-vtg1,并进行菌刺激,结果发现部分抗菌肽表达量下调。这些研究结果表明Es-vtg1具有重要的抗菌功能。
【图文】：

图 2.3.1 Es-vtg1 的 cDNA 序列和氨基酸序列分析。核苷酸和氨基酸序列的编号分别显示在左边和右边。起始密码子的字体是用绿色表示，终止密码子的字体用红色表示的。Poly A 尾（AATAAA）用方框表示。在 Es-vtg1 的 LPD_N 结构域以红色背景突出显示，DUF1943 结构域以蓝色背景突出显示，而 VWD 结构域以绿色背景突出显示，预测的裂解位点序列用下划线表示。Fig. 2.3.1 Sequence analysis of the cDNA and predicted peptide sequence of Es-vtg1. The numbering of the nucleotide and amino acid sequences is shown to the leftand right, respectively. The start codon is indicated in green and the stop codon isindicated in red; the polyadenylation site (AATAAA) is indicated in a box. The LPD_Ndomain of Es-Vtg1 is highlighted in red, the DUF1943 domain is highlighted in blue,and the VWD domain is highlighted in green. Predicted cleavage site sequences areunderlined.

图 2.3.2Es-Vtg1 蛋白结构域分析。Es-Vtg1 含有三个功能性结构域：LPD_N结构域、DUF1943 结构域和 VWD 结构域。Fig.2.3.2 Domain structure analysis of the putative Es-Vtg1 protein, whichincludesthreefunctional domains:anLPD_Ndomain,aDUF1943domain,andaVWDdomain.我们利用 MEGA4.1 进行进化树的构建，，卵黄蛋白原序列来自 10 个物种，构建方法为 neighbor-joining 法。进化树结果显示分为两支， 支为脊椎动物，支为无脊椎动物，系统进化树的结果与各物种的进化地位 致（图 2.3.3）。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

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本文编号：2632298