周期蛋白依赖性激酶2调节中华绒螯蟹造血过程的机制初探

发布时间：2020-04-18 12:49

【摘要】：造血作用是指未成熟的血淋巴细胞分化为成熟的血细胞和淋巴细胞的过程,其对动物生存起到至关重要的作用。周期蛋白依赖激酶(CDKs)是细胞周期调节过程中的核心分子,参与调节高等动物的细胞分裂,细胞分化,配子形成等生命过程,其与造血系统的互作网络引起研究人员的广泛关注。目前研究发现,周期蛋白依赖激酶在无脊椎动物中同样发挥着重要的作用,但其对无脊椎动物,尤其是甲壳动物造血过程调控方面的研究十分有限。本论文从甲壳动物的造血过程入手,利用生物化学,细胞生物学,分子生物学等技术手段,以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为研究对象,克隆得到了EsCDK2的c DNA序列,分析了其组织与细胞分布特征和对造血刺激的响应模式,对EsCDK2的造血调节机制开展了初步研究。从中华绒螯蟹中鉴定得到一个含有丝氨酸/苏氨酸蛋白酶结构域的周期蛋白依赖激酶分子EsCDK2,并对其分子序列及组织分布特征进行了分析。EsCDK2的cDNA序列全长2405 bp,含有一个909 bp的开放阅读框,编码302个氨基酸。EsCDK2氨基酸序列与其他物种已知的CDK2序列同源性较高,序列相似度为66%-81%。分子进化分析表明,EsCDK2能与斑节对虾中的CDK2聚为一簇,其亲缘关系较近。qRT-PCR检测发现,EsCDK2的mRNA表达量在血淋巴细胞中最低,在心脏和肌肉中表达量较低,而在造血组织和性腺中的表达量较高,分别是血淋巴细胞中表达量的141倍和87倍。通过免疫组化法进行亚细胞定位发现,EsCDK2在造血组织细胞的细胞核和胞浆中均有分布。中华绒螯蟹造血组织细胞中Es CDK2的mRNA表达量在脂多糖(2.02倍,p0.05)和嗜水汽单胞菌(2.31倍,p0.05)刺激3小时后显著上升。血淋巴细胞总数在抽血刺激0.5小时后显著降低(0.39倍,p0.05),达到0.42×10~7个/毫升,之后逐渐上升并在6小时恢复至正常水平。利用RNA干扰技术研究了Es CDK2对于造血组织细胞增殖的影响。注射Es CDK-dsRNA后24小时,造血组织中EsCDK2的mRNA表达量显著降低(0.53倍,p0.01);造血组织细胞中新生血细胞占比由37.7%降至16.3%(0.43倍,p0.01),表明随着EsCDK2被抑制,造血作用显著减弱。利用流式细胞仪对造血组织细胞进行细胞周期分析发现,注射EsCDK2-dsRNA后处于G0-G1时期的细胞占比显著上升至85.01%(1.26倍,p0.01),而处于S期和G2-M期的细胞占比分别显著下降至7.92%(0.46倍,p0.01)和7.07%(0.43倍,p0.01),表明Es CDK2表达被抑制后造血组织细胞的细胞周期在G1期出现阻滞。综上,EsCDK2在结构上与高等动物的CDK2相似度较高,主要在造血组织细胞和性腺细胞中表达。在免疫刺激和抽血刺激后,中华绒螯蟹血细胞总数显著降低,造血组织中EsCDK2的m RNA表达量显著上升。EsCDK2被干扰后,血细胞总数和新生血细胞数均显著降低,且造血组织细胞的细胞周期在G1期发生阻滞,表明EsCDK2通过调节造血组织细胞由G1期向S期转变,参与调节中华绒螯蟹的造血过程。研究结果对深入探索甲壳动物免疫系统的组成和造血作用的调节机制具有重要的指导意义。
【图文】：

序列,哺乳动物,家族,脯氨酸

CDKs 在进化上是高度保守的，从低等的真核生物酵母到高等哺乳动物人依赖 CDKs 对细胞周期进行调控，但不同生物细胞周期的调控机制相差很如，酵母中只有一种 CDK，而人类以及其他哺乳动物中则有多个 CDK 分子胞周期的不同阶段发挥作用。虽然 CDK 的数量不同，但细胞周期的基本调则是相同的，即 CDK 分子与周期蛋白结合发挥细胞周期调节作用，因此 CD泛存在于各个物种当中(Lim and Kaldis, 2013)。1.2 CDKs 的分子结构作为典型的 CMGC 激酶家族成员，CDK 属于脯氨酸引导的丝氨酸/苏氨白激酶。由于其结合脯氨酸的位点附近存在疏水口袋结构，所以 CDK 序列常含有 S/T-P-X-K/R 序列。但 CDK4 分子中不存在疏水口袋结构，因此其序无上述特征序列；CDK7 和 CDK9 并不是脯氨酸引导的丝氨酸/苏氨酸蛋白，因此它们可以不依赖脯氨酸而行使磷酸化底物的功能(Echalier et al., 201

三维结构,结构域,苏氨酸蛋白激酶,周期蛋白

第一章绪论CDKs 的氨基酸序列长度范围从大约 250 个氨基酸残基，与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域大小相当，到 1500 个氨基酸残基，除丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域外还拥有不同的 C 端和 N 端序列（图 1.1）。与其他激酶一样，CDK 具有双叶结构，，N 端叶含有大量的 β 折叠，而 C 端叶富含 α 螺旋，活性位点位于两叶中间。除此之外，其 N 端叶包含一个富含甘氨酸的抑制元件和一个 C 螺旋，其 C端则包含激活元件，例如 CDK2 中的 DFG 结构域，APE 结构域和磷酸化位点T160(De Vivo et al., 2011)。当 CDK 未结合周期蛋白时，其活性区域被 T 螺旋关闭，因此不具有激酶活性；当 CDK 与周期蛋白结合后，其活性区域打开，CDK具有了磷酸化底物的活性（图 1.2）。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

【参考文献】