大黄鱼源杀香鱼假单胞菌外膜蛋白的预测、克隆表达及免疫原性初步分析

发布时间：2020-04-19 01:09

【摘要】：大黄鱼(Larimichthys crocea)源杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是引起大黄鱼内脏白点病的主要致病菌,该病每年在我国沿海网箱养殖的大黄鱼上均有不同程度的爆发,发病后致死率高、危害严重,目前尚无有效防治措施,给大黄鱼养殖业造成了巨大损失。本研究根据NCBI收录的杀香鱼假单胞菌NB2011株全基因组序列(GenBank Accession:NZ_ASJX00000000),基于反向疫苗的开发思路,通过生物信息学数据库从基因组中预测、筛选菌体的外膜蛋白作为候选免疫原,将其克隆后在大肠杆菌中重组表达,并对获得的重组蛋白进行免疫原性分析,研究结果如下:一、本研究从NB2011株基因组中共预测、筛选出28个外膜蛋白基因作为候选免疫原,其中10个为外膜结构蛋白,10个为毒力分泌相关蛋白,3个脂蛋白,2个孔蛋白,其他外膜蛋白3个。二、通过设计基因扩增引物,成功克隆出28个外膜蛋白的基因,经测序比对,其中27个基因的序列与NB2011株100%吻合,其中1个编号P10(EPB95217)的基因与NB2011株存在1个碱基的差异,多次重复试验均证实差异的存在,分析表明,该处碱基差异不会终止翻译,应为有效的编码序列。三、本研究成功构建了28个外膜蛋白的原核表达载体(pET-30(a)-n),通过优化诱导表达条件,共有18个重组蛋白在大肠杆菌中成功表达,经包涵体检测,其中2个蛋白为可溶性表达,其余16个为包涵体形式。四、制备了效价为1∶6400的新西兰兔抗杀香鱼假单胞菌多克隆抗体,应用抗体对重组表达的18个外膜蛋白进行了免疫原性的Western Blot分析,结果表明,与有10个重组蛋白与多抗结合较强,有8重组蛋白与多抗结合稍弱。五、从兔抗检测具有较强免疫原性的重组外膜蛋白中,选取了P15、P16、A6、B6四个外膜蛋白进行了鱼体免疫攻毒试验,结果表明,大黄鱼攻毒后第6天开始出现死亡,检剖内脏有明显白点,至第14天时,统计得到免疫组中P15、P16的相对保护率分别为15.79%和5.26%,A6和B6的相对保护率分别为68.42%和52.63%。综上,本研究运用反向疫苗原理开展了大黄鱼源杀香鱼假单胞菌外膜蛋白亚单位疫苗抗原的预测、制备和初步筛选等工作,研究结果为大黄鱼内脏白点病的疫苗防治提供了有益的借鉴。
【图文】：

胞菌基因组 DNA 浓度及条带分所用的材料菌株 ZS1306003，是由大黄鱼内脏。菌株经平板划线复苏养，，使用试剂盒抽提全基因组 D凝胶电泳结果如图 1 所示，条带度高，说明基因组提取完整，降解程。

图 2.候选外膜蛋白基因 PCR 产物胶照片Fig 2. Photo of candidate outer membrane protein gene PCR product gel编号引物Tm 值(F/R)退火温度(℃)片段长度72℃延伸时间编号引物Tm 值(F/R)退火温度(℃)片段长度72℃延伸时间A1 61/71 61 1149bp 65s P28 62/62 62 1191bp 75sA2 60/64 61 1269bp 70s P29 61/63 62 636bp 45sA3 69/81 69 1239bp 75s P30 66/64 65 675bp 45sA5 61/79 62 1239bp 75s P3 55/63 54 840bp 50sA6 58/59 59 1335bp 80s P7 51/72 51 774bp 45sB1 79/61 61 762bp 50s P9 68/72 65 1338bp 80sB4 59/63 59 768bp 50s P10 67/64 64 1020bp 60sB6 61/64 61 594bp 40s P11 64/69 64 501bp 30sB10 73/75 73 717bp 45s P12 52/53 53 693bp 45s
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S943

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本文编号：2632753