传染性胰脏坏死病毒VP2蛋白的酵母展示系统的建立和免疫保护效果初步评价

发布时间：2020-04-19 01:20

【摘要】：传染性胰脏坏死(Infectious pancreatic necrosis,IPN)是由属于双RNA病毒科(Birnaviridae)水生双RNA病毒属(Aquabirnavirus)的传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)引起的一种严重的鱼类急性传染病。该病主要危害鲑鳟幼鱼,也可造成成年鲑鳟和许多其他鱼类严重的急性感染,流行范围遍及亚洲、欧洲、美洲多个国家。1986年在我国山西省虹鳟鱼场首次暴发IPN,随后我国多地区接连报道IPN疫情,2013年在我国云南省分离到血清型为A9的IPNV毒株ChRtm213(登录号KX234591),是不同于以往血清型的我国现行IPNV毒株。本研究针对我国现行IPNV毒株开展了以活酵母为载体的口服疫苗研究,以期为IPNV免疫防控奠定基础。VP2蛋白是IPNV的主要抗原蛋白,是作为病毒检测及疫苗构建的主要蛋白基因。为了将VP2蛋白展示于酵母细胞表面,本研究基于IPNV VP2蛋白基因序列设计了引物,以IPNV ChRtm213的RNA为模板,进行PCR扩增,然后将扩增产物连接到酵母表面展示载体pYD1上构建了重组质粒pYD1-VP2,将重组质粒转化酵母EBY100感受态细胞,得到含有重组质粒的酵母菌EBY100-pYD1-VP2。向EBY100-pYD1-VP2加入半乳糖进行VP2蛋白的诱导表达,采用蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光技术对VP2蛋白的酵母表面展示情况进行了分析。蛋白免疫印迹结果显示经半乳糖诱导后VP2蛋白在酵母细胞表面获得了成功表达;细胞免疫荧光分析结果显示重组酵母诱导表达后出现特异性绿色荧光,并且在一定时间内,荧光强度与诱导时间成正相关,免疫实验组与对照组相比荧光酵母比例差异显著(P0.05)。上述研究结果表明VP2蛋白已经被酵母细胞高效表达并且成功展示于酵母细胞表面。为了评价该口服疫苗的免疫效果,对虹鳟鱼(5±1克平均体重)进行了口服免疫试验。虹鳟鱼(5±1克平均体重)分为3组,每组包含150尾虹鳟鱼(设两个平行),将表达了VP2蛋白的新鲜酵母细胞EBY100-pYD1-VP2(1×10~(10)CPU/ml)悬浮于100 uL PBS中,通过口服强饲法对各组虹鳟鱼接种100 uL/尾。另外设空载体组饲喂酵母细胞EBY100-pYD1(1×10~(10) CPU/ml)和PBS组饲喂PBS溶液。在免疫后第30天,对疫苗组、空载体组和PBS组虹鳟进行腹腔注射攻毒,攻毒剂量为100 uL 100TCID50/ml IPNV病毒悬液,攻毒后第30天采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)测定疫苗组、空载体组和PBS组虹鳟VP1和VP4基因的表达水平以确定虹鳟体内病毒载量,以不攻毒的虹鳟为阴性对照。病毒载量实验结果显示在攻毒后第30天,空载体组和PBS组虹鳟VP1基因的载量分别为疫苗组的147倍和181倍。VP4基因的表达量为分别为170倍和189倍。该结果表明,用EBY100-pYD1-VP2接种可使虹鳟的平均病毒载量显著降低(P0.05)。在免疫后第60天,采用中和抗体实验(Neutralizing antibodies test)测定疫苗组和空载体组虹鳟血清IPNV中和抗体效价。中和抗体实验结果显示,在免疫后第60天,疫苗组虹鳟血清IPNV平均中和抗体效价为30.2,显著高于空载体组(P0.05)。在免疫后第7天和14天,利用RT-qPCR定量分析疫苗组、空载体组和PBS组虹鳟头肾、脾脏和后肠组织中IgM、IgT、CD4和CD8基因的表达水平。实验结果显示,在免疫后第7天,疫苗组虹鳟头肾中IgM和IgT的表达量分别为PBS组的6.9倍和5倍,脾脏中为7.9倍和5.6倍,后肠中为8.6倍和5.8倍,与PBS组相比,疫苗组虹鳟头肾、脾脏和后肠中IgM和IgT基因的表达显著上调(P0.05)。在免疫后第7天,疫苗组虹鳟头肾中CD4和CD8的表达量分别为PBS组的5.3倍和8.2倍,脾脏中为7.1倍和8.7倍,后肠中为PBS组的8.6倍和7.2倍,疫苗组虹鳟头肾、脾脏和后肠中CD4和CD8基因的表达显著上调(P0.05)。在免疫后第14天,疫苗组虹鳟脾脏和后肠中CD4表达水平分别为PBS组的11倍和8.2倍,CD4基因表达显著上调(P0.05)。综合病毒载量、中和抗体效价分析和免疫相关基因表达量分析结果,口服接种EBY100-pYD1-VP2使虹鳟体内IPNV载量显著下降,并且产生较高水平的中和抗体效价,诱导了免疫相关基因IgM、IgT、CD4和CD8表达的显著增加。本研究表明利用酵母表面展示系统构建的IPNV口服疫苗能够显著降低虹鳟体内IPNV病毒载量,刺激虹鳟非特异性免疫和特异性免疫反应,为今后制备抗IPNV的新型口服活载体疫苗的研发奠定了基础。
【图文】：

氨基酸序列,片段基因,组序,进化树

感染 IPNV后的病鱼常具有食欲减退、体色发黑、眼球突出、腹部肿胀、肛门红肿等症状，，解剖后可见胰腺坏死、肾脏肿大、肠内有粘液状渗出物、腹水等症状[13]。晚期病鱼的肝脏和鳃上皮组织严重出血，肝脏和胰脏细胞核固缩，出现空泡变性，胰腺中有炎症细胞浸润的脂肪组织发生弥散性坏死[13]。感染 IPNV 幸存的鱼可不再发病，但是终生携毒，依然能传染病毒。IPNV可通过携带病毒的水体、网具、容器、染病鱼的排泄物和精液进行水平传播[13]。1.3 基因型分型用 MegAlign 软件分析基因型，以 VP2 基因片段为目标基因，同 GenBank 收录的其他国家 IPNV分离株及部分水生双 RNA病毒进行 VP2 核苷酸序列同源性分析。Blake[36]等证明，IPNV病毒基于 VP2 氨基酸序列可分为 6 个基因组 genogroups（1-6）。一些研究者认为，海洋双 RNA 病毒应该形成一个新的基因组genogroup7[37-38]，Ji 等对一株分离于虹鳟的中国 IPNV毒株 ChRtm213 采用邻位相邻法构建了 IPNV的系统进化树（图 1-1）[39]。该进化树清晰地将目前水生双 RNA病毒分为 7 个基因组。

原理图,展示系统,酵母,原理图

膜免疫主要通过口服抗原引发。刘-VP3 重组蛋白并进行口服免疫，结，对 IPNV的入侵起到保护作用。可以将外源蛋白展示在酵母表面的在酵母表达载体的 Aga2 基因下游蛋白融合蛋白会在信号肽的作用下 Aga2 蛋白亚基识别酵母表面的 A之融合的目的蛋白间接的锚定在酵，酵母细胞还可以对蛋白进行修饰[18]。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S948

【参考文献】