人工诱导日本鳗鲡繁殖过程中肝脏的组织变化及卵的营养成分和初孵仔鱼转录组分析

发布时间：2020-04-19 06:18

【摘要】：日本鳗鲡是一种广泛分布的降海洄游性鱼类,营养价值丰富,由于长期捕捞,生存环境的恶化,其数量正逐年下降。目前,日本鳗鲡的人工繁殖、育种仍有许多重难点未被突破。在近几年的繁殖工作中,发现催熟催产的雌鳗肝脏异常肿大,肝脏是卵黄蛋白原的主要合成器官,卵黄蛋白原在卵细胞中转变为卵黄蛋白,是初孵仔鳗未的内源性营养,因此,雌鳗肝脏组织的变化对初孵仔鳗的存活至关重要,通过光学切片和透射电镜切片观察不同产卵情况下雌鳗肝细胞的变化,检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、和肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及雌鳗体内卵黄蛋白原的含量,以此来验证在外源激素诱导性腺发育过程中,雌鳗肝脏是否出现损伤,卵黄蛋白原的分泌量是否导致了不同产卵状况的发生。初孵仔鳗的开口饵料也一直是鳗鲡育苗的重难点,通过对鳗鲡卵的营养成分的检测分析,确定了仔稚鳗饲料中各营养物的理论需求量,为仔稚鳗的开口饵料的研究提供了基础。随着近几年来转录组测序技术的完善,通过初孵仔鳗的转录组测序,分析部分与营养物质消化吸收的基因,为今后初孵仔鳗的营养物质探索提供依据。1.切片实验观察发现,对照组与实验组的主要区别如下:第一,肝细胞变形,细胞质减少;第二,大量的空泡结构在细胞中出现,这些空泡结构就是脂滴;第三,参与催熟的雌鱼肝细胞中,粗面内质网的数量多,且发达;第四,糖原颗粒减少。接受性腺催熟的雌鳗,肝脏中出现许多脂滴,这是卵黄蛋白原大量合成的证据,并且产卵状况越好的雌鱼脂滴体积越大。难产组、人工授精组脂滴体积小于自然对照组,因此推测这两组合成的卵黄蛋白原可能要少于自然产卵组。虽然在性腺发育过程中,肝细胞的形态发生巨大变化,但并不能说明这些变化是不可逆的,通过退化组与自然产卵组、人工授精组的对比,发现退化组的肝细胞形态,细胞质的丰富度正逐渐向对照组靠拢。这就说明,当停止外源激素的诱导时,肝细胞是可以恢复的。通过对肝功能酶的检测发现:谷草转氨酶在对照组、难产组、自然产卵组、人工授精组、退化组的活性分别为(78.20±2.01)、(87.73±3.78)、(86.33±6.35)、(83.21±1.48)、(81.80±1.78)U/L。其中,自然产卵组、难产组与对照组相比,谷草转氨酶活性均显著提高(P0.05)。谷丙转氨酶在对照组、人工授精组、退化组、自然产卵组、难产组中的活性分别为(12.80±0.56)、(19.57±1.84)、(19.10±2.51)、(18.6±1.37)、(18.53±2.10)U/L。与对照组相比,其它组的活性均显著提高。超氧化物歧化酶在对照组、难产组、自然产卵组、退化组、人工授精组的活性分别为(63.35±2.50)、(95.29±6.14)、(81.13±8.49)、(79.97±3.31)、(78.45±9.87)U/mL。与对照组相比,其余各组的活性均显著提高;自然产卵组、退化组、人工授精组的酶活性均显著低于难产组。说明:在外源激素作用下,雌鳗的肝脏出现损伤,难产组的损伤程度更深。对照组、自然产卵组、人工授精组、难产组、退化组,血清中的卵黄蛋白原含量分别为(2.49±0.19)、(4.18±0.19)、(4.26±0.15)、(3.48±0.50)、(2.63±0.21)μg/mL。除退化组之外,其余各组含量均显著高于对照组;自然产卵组、人工授精组的含量要显著高于难产组。肝脏中,各组含量分别为(6.58±0.29)、(7.20±0.55)、(7.05±0.72)、(6.62±0.59)、(6.63±0.14)μg/mL。各组间均不存在显著差异。性腺中,各组含量分别为(387.73±3.84)、(454.57±17.08)、(418.94±6.50)、(419.16±16.20)、(418.24±17.87)μg/mL。与对照组相比,其余各组的含量均显著提高。退化组、难产组的含量显著低于人工授精组、自然产卵组。就此说明,在雌鳗性腺发育后期,肝脏中合成卵黄蛋白原的能力已经下降;卵黄蛋白原的分泌量直接影响雌鳗的产卵。2.对人工繁殖下获得的鳗鲡卵进行营养成分分析得知,初孵仔鳗对饲料中蛋白质和脂肪的需求量分别59.59%和40.86%。干物质基础下总氨基酸(TAA)的含量为8.07%,必需氨基酸(EAA)的含量为3.19%,非必须氨基酸(NEAA)的含量为4.88%。与其它鱼卵进行对比,发现氨基酸含量较低,所以应将本实验中获得的氨基酸含量作为饲料配比中的最低值,应在初孵仔鳗的饲料中添加氨基酸的含量,特别是作为第一限制氨基酸的缬氨酸。鲜重基础下鳗鲡卵中DHA的含量为25.98%,EPA含量为4.27%,EPA+DHA的含量为30.25%。在初孵仔鳗饲料配比中,可根据生长状况适当增加饵料中DHA的含量,促进其生长,而对于EPA的含量,可将实验中的值作为理论参考。总之,本次研究中所获得的各营养素需求量,仅为初孵仔鳗的开口饵料设计提供理论参考,而各营养素的实际需求量还需要根据具体状况来确定。3.通过对5个时期的初孵仔鳗转录组进行测定,建立相关的转录组文库,分析初孵仔鳗基因表达变化。本次测序共获得基因102941条、结合NR、COG、GO、和KEGG等多个数据库注释的对比分析得知初孵仔鳗具有完善的代谢机制和较强的代谢活力,以及蛋白翻译过程中较高的基因表达。对5个发育阶段的差异unigenes比较分析,发现:在文库A与B的对比中发现有33487个差异基因;在B与C的比较中,有3773个差异基因;C与D对比,有1506个差异基因;D与E对比,有84个差异基因。说明各时期下的初孵仔鳗转录组基因表达发生变化。在KEGG富集的通路上,选取蛋白质消化吸收、脂质消化吸收、矿物质消化吸收、碳水化合物消化吸收和维他命消化吸收的通路对差异基因进行分析,得知初孵仔鳗对蛋白质和糖类的消化吸收水平逐渐提高,对脂肪的消化吸收水平在前3天内较高,之后逐渐下降趋于稳定。
【图文】：

照片,自然产卵,照片,对照组

15图 1 雌鳗肝脏组织光镜观察照片Fig.1 Morphology of female eel’s liverA：对照组；B：自然产卵组；C：工授精组；D：难产组；E：退化组A: control group; B: natural spawning; C: artificial spawning; D: difficult spawning; E:degeneration group

照片,透射电镜,照片,自然产卵

19图 2 雌鳗肝脏组织透射电镜照片Fig.2 Ultrastructure of female eel’s liverA-1、A-2：对照组；B-1、B-2：自然产卵组；C-1、C-2：工授精组；D-1、D-2：难产组；E-1、E-2：退化组；N：细胞核；Nu：核；RER：粗面内网；M：粒体；Gl：糖原颗粒；L：脂滴；Ly：溶酶体A-1、A-2: control group; B-1、B-2: nature spawning; C-1、C-2: artificial spawning; D-1、D-2: difficult spawning; E-1、E-2: degeneration group; N: nucleus; Nu: nucleolus; RER:rough endoplasmic reticulum; M: mitochondria; Gl: glycogenosome; L: lipid droplet;Ly: lysosome
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

【参考文献】