罗氏沼虾雌激素相关受体的克隆与表达及壬基酚对其表达的影响

发布时间：2020-05-09 21:57

【摘要】：雌激素是一种性类固醇激素,在动物体内发挥着十分重要的生理作用,主要是通过雌激素受体来介导发挥其相应的雌激素功能。性腺发育是由众多调控因子共同作用完成的,其中雌激素及其受体已经被认为是卵巢发育的重要调控因子中的一部分。在无脊椎动物中却未发现雌激素受体(estrogen receptor, ER)的存在,却存在另一个同源性极高的基因,故而命名为雌激素相关受体(estrogen related receptor, ERR)。但目前在甲壳动物发育过程中对雌激素相关受体的研究尚未有过多报道,因此对此类核受体的研究更有利于阐述雌激素参与其上下游的信号通路。本文拟用罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)作为该研究的实验用虾,展开了对雌激素相关受体的相关研究。利用同源克隆的方法以及RACE技术,克隆得到了罗氏沼虾雌激素相关受体的cDNA全长,使用半定量PCR(SqRT-PCR)的方法检测ERR在雌雄个体中组织分布,利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测不同浓度壬基酚暴露以及不同时间处理对罗氏沼虾雌虾卵巢中ERR mRNA表达量的影响。采用生物信息学方法分析ERR基因开放阅读框序列、保守区和同源性等,并构建原核表达载体pET-32a-ERR,使用镍柱亲和层析表达产物从而纯化目的蛋白。主要研究结果如下：1.罗氏沼虾ERR基因的cDNA克隆及序列分析罗氏沼虾ERR基因的cDNA序列全长为1897 bp,包含了一段长1374 bp的开放阅读框(ORF),143 bp的5’-UTR和380 bp的3'-UTR,编码了457个氨基酸残基,分子量50.75 kDa。氨基酸序列分析表明,罗氏沼虾雌激素相关受体含有核受体家族典型的结构域。2.罗氏沼虾ERR基因的组织表达差异研究组织分布结果表明,ERR在雌虾心脏和卵巢中表达量较高,在脑神经节和肝胰腺中信号较弱,而在眼柄、肌肉和鳃中未见表达：ERR在雄虾心脏中表达量较高,在脑神经节、肝胰腺、精巢、鳃中表达量较低,而在眼柄和肌肉中亦未见明显信号,推测ERR可能在卵巢发育中发挥了重要作用。3.壬基酚对罗氏沼虾ERR mRNA表达的影响用不同浓度NP(5,25和125μg/L)在体暴露罗氏沼虾两周后,发现所有处理组均能显著促进卵巢ERR mRNA的表达(P0.05),当处理浓度超过25μg/L时,壬基酚发挥的雌激素效应将维持稳定；以25μg/L的NP在体暴露罗氏沼虾,数据分析显示,NP暴露6天时ERR mRNA的表达量已有显著增加,随着处理时间的增加,ERR mRNA的表达量均能极显著提高,其中18天达到峰值,尽管18天后依然相对于对照组ERR表达量显著增加,但是雌激素效应稍有下调趋势。4.ERR基因的原核表达与纯化将ERR基因ORF序列克隆至原核表达载体pET-32a中,构建了重组表达载体pET-32a-ERR,经过条件优化,最终在温度为37 ℃, 0.1mmol/L的IPTG,诱导时间为4 h,摇床培养的转速为200 rpm的条件下对目的蛋白进行大量诱导表达,表达产物经纯化、SDS-PAGE检测,获得与预期大小相符的70 kDa重组蛋白。综上所述,本文对罗氏沼虾ERR基因进行了初步研究,并探索了环境内分泌干扰物对其表达调控作用；建立了原核表达体系,并获得ERR蛋白,为下一步目的蛋白的功能验证,多克隆抗体的制备等研究奠定了基础,为研究ERR在罗氏沼虾发育过程中的调控机制提供了基础数据。
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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