三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）早期胚胎免疫及凝集素途径关键分子研究

发布时间：2020-05-14 18:21

【摘要】：目前有关蟹类免疫防御的研究大多数都集中在成体,胚胎如何保护自己免受病原体攻击这一发育免疫学中的关键问题却鲜有报道。本研究报道了我国重要的水产养殖蟹类三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)早期胚胎的免疫功能并探讨其免疫机制。实验表明,三疣梭子蟹受精卵蛋白提取液对革兰氏阴性菌溶藻弧菌、革兰氏阳性菌藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌、真菌毕赤酵母菌的生长过程具有明显的抑制作用,而对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌和大肠杆菌抑制效果不明显或无抑制效果。三疣梭子蟹受精卵蛋白提取液对溶藻弧菌、大肠杆菌以及毕赤酵母菌具有明显的凝集活性和损伤作用,而对铜绿假单胞菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌无凝集和损伤作用。酶活实验表明,溶菌酶和Cu/Zn-SOD的活力随胚胎发育时期呈现逐渐上升的趋势。ELISA实验结果表明,补体系统的关键分子C3和C4存在于受精卵中,与以上酶活实验结果不同,C3和C4随胚胎发育时期呈现先下降后上升趋势且受精卵和卵裂期含量明显高于囊胚期,推测其可能是重要的母源免疫分子。补体凝集素途径的激活需要Ca~(2+)参与,金属离子螯合实验显示,在受精卵蛋白提取液中添加Ca~(2+)螯合剂后,其抑菌活性明显降低,而补充足量的Ca~(2+)后,其抑菌活性在一定程度上得到了恢复,相反抑制替代途径再补充其所需的Mg~(2+)不能使抑菌活性得到恢复。以上研究结果表明,三疣梭子蟹的受精卵蛋白提取液具有抑菌、凝菌和菌损伤活性,溶菌酶、Cu/Zn-SOD和补体凝集素途径在早期胚胎的免疫保护中发挥重要作用。补体凝集素途径关键分子甘露糖结合凝集素(MBL)和纤维胶凝蛋白(ficolin)作为关键的模式识别受体(PRR)在先天免疫反应中起重要作用。本研究从三疣梭子蟹中克隆出了一种新的甘露糖结合凝集素(命名为PtMBL)和新的纤维胶凝蛋白(命名为Ptficolin)。PtMBL基因的cDNA全长为1208bp,开放阅读框(ORF)长度为732bp,编码含有244个氨基酸的蛋白质。经过多序列比对显示PtMBL与其他物种中的MBL具有较低的氨基酸相似性,但它含有具有QPD基序的保守碳水化合物识别结构域(CRD)。PtMBL主要在眼柄和鳃中检测到且经溶藻弧菌,藤黄微球菌和毕赤酵母菌刺激后,血细胞中PtMBL被不同程度的激活。重组PtMBL蛋白显示出针对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑菌活性并且可以结合并凝集细菌和真菌(具有Ca~(2+)依赖性)。此外,D-半乳糖和D-甘露糖都可以抑制凝集活性,这表明PtMBL具有更广泛的病原体相关分子模式(PAMPs)识别谱。Ptficolin基因的cDNA全长为2183bp,开放阅读框(ORF)长度为963bp,编码含有321个氨基酸的蛋白质。经过多序列比对显示Ptficolin与其他无脊椎动物中的ficolin具有较低的氨基酸相似性,但与其他已经鉴定出的无脊椎动物的ficolin具有保守的信号肽和FBG结构域。Ptficolin主要在肝胰腺、眼柄和胸神经节中检测到且用经过溶藻弧菌,藤黄微球菌和毕赤酵母菌刺激后,血细胞中Ptficolin可产生快速响应。这些结果共同表明,PtMBL和Ptficolin不仅可以作为免疫识别中的模式识别受体,而且可以作为蟹类的先天免疫反应中潜在的抗菌蛋白发挥作用。
【图文】：

激活途径,凝集素,补体系统,无脊椎动物

图 1.1 凝集素激活途径（Mihaela 等.，2001）Fig.1.1 Lectin pathway (Mihaela 等.，2001)1.2.3 无脊椎动物补体系统研究进展

受精卵,三疣梭子蟹,溶藻弧菌,铜绿假单胞菌

第 2 章三疣梭子蟹早期胚胎免疫及补体功能研究2.1.3.2 受精卵蛋白提取液对微生物生长的抑制作用通过测量菌液生长不同时间的 OD 值发现三疣梭子蟹受精卵蛋白提取液对不同菌种的生长具有不同程度的抑制作用（图 2.2）。实验结果表明，三疣梭子蟹的受精卵蛋白提取液对溶藻弧菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和毕赤酵母菌的生长有不同程度的抑制作用（图 2.2A，，D，E 和 F），且抑制程度与受精卵蛋白提取液浓度呈正相关，添加初始浓度（14.3mg/ml）的受精卵蛋白提取液比稀释 5 倍的（浓度 2.86mg/ml）具有更强的抑菌能力，能够显著的抑制菌的生长。且不同浓度的受精卵蛋白提取液对于微生物的生长抑制作用均显著高于 PBS 对照组。然而，受精卵蛋白提取液对于大肠杆菌和铜绿假单胞菌的生长几乎无抑制作用（图 2.2B，C）。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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