半滑舌鳎LGR8基因克隆和CSW3基因的功能验证

发布时间：2020-05-17 01:21

【摘要】：LGR8是胰岛素样因子3(INSL-3)在体内的特异性受体,属于G蛋白偶联受体(GPCR)大家族。哺乳动物中LGR8高表达于睾丸引带等组织;在人类研究中发现编码LGR8和INSL-3的两个基因分别控制着哺乳动物雄性器官下降所必需的腹股沟韧带和索状引带的分化发育。目前一般认为,LGR8或INSL-3的突变有可能导致隐睾症的发生。本实验在对半滑舌鳎全基因组测序与转录组测序的基础上,通过RACE的方法克隆得到了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)LGR8基因全长,该基因全长为2768bp,共编码734个氨基酸。对其进行实时荧光定量PCR结果显示,在成熟性腺中,LGR8在雄性中主要在脑、性腺中表达;在雌鱼体内各组织中表达无显著差异,且雄鱼性腺和脑中的表达量要显著高于雌鱼;通过对不同时期的性腺进行实时荧光定量PCR结果显示,LGR8基因在鱼体发育80天左右表达量开始上升,150d~210d表达量达到最大,这表明LGR8在半滑舌鳎性别决定和性腺发育中起到一定的作用。CSW3是本实验室在对半滑舌鳎基因组测序与转录组测序的基础上克隆得到的半滑舌鳎特有且在雌性性腺中高表达的基因,我们通过RACE技术克隆得到了半滑舌鳎CSW3基因c DNA全长。CSW3 c DNA基因全长为1714bp,其中5端非翻译区长173bp,3端非翻译区长929bp,编码区为612bp,编码共204个氨基酸。通过定量PCR实验结果表明,CSW3基因为组织广谱性表达,且在卵巢中表达最高。实验通过分析CSW3重组蛋白注射性腺后Dmrt1、Sox9、Amh、P450等性别决定相关基因的表达调控,探讨CSW3在半滑舌鳎性别决定与分化中的作用。重组蛋白注射半滑舌鳎性腺后实时定量PCR分析结果显示,Dmrt1、Sox9、Amh、P450等基因的表达量有不同程度的上调和下调,证明了CSW3蛋白具有一定的活性,可能一定程度上在性别决定中发挥重要作用。
【图文】：

半滑舌鳎,个体性,雄鱼,雌鱼

图 2-1 半滑舌鳎雌雄鱼个体性腺细胞(A 为雄鱼，B 为雌鱼)Fig 2-1 The natural ovary and testis in half smooth tongue sole(Cynoglossus semilaevis).4.4.2 PCR 验证遗传性别用合成的性别鉴定引物进行 PCR 扩增，PCR 扩增体系为 15.0μL。PCR 结束后通糖凝胶电泳进行检验，遗传雄性为一条带，遗传雌性为两条带(具体实验步骤参考本.4.1.1 和 2.4.1.2)。.4.5 LGR8 基因实时定量 PCR 表达分析实时荧光定量 PCR 是指在 PCR 反应过程中加入带荧光物质，使其结合在 DNA 双定位置上，利用荧光信号的大小实时监测 PCR 进程和反应量的变化，再通过制作标对实验模板实现定量分析的方法。根据得到的半滑舌鳎 LGR8 基因的编码区序列，，对表达分析引物 1339 LGR8-F 和 1476 LGR8-R 详见表 2-1 进行实时定量 PCR (ReaCR)。以 β-actin 为内参进行实时定量分析。实验将 3 龄半滑舌鳎不同组织，包括脑、肠、肾、心脏、脾脏、血液进行了定量分析，同时对不同时期半滑舌鳎性腺，包括

氨基酸序列,半滑舌鳎,基因序列,翻译起始

小方框内为翻译起始位点和终止位点，长方框内为 7tm-1 结构域，下划线为 LDL-A 区域，为 LRRs 区域Fig.2-2 ORF sequence and deduced amino acid sequence of LGR8 in half smooth tongue-sole. Tlocus (ATG) and the terminal locus (TGA) are boxed in the short frame and the 7tm-1 motif is boxlong frame. LDL-A is underlined. The LRRs sequences are indicated in the shadow.
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4

【参考文献】