草鱼出血性疾病病原体的鉴定、致病性及免疫防治研究

发布时间：2020-05-17 05:09

【摘要】：鱼类出血性败血症(Septicemia)是我国水产养殖业中最为常见的流行病,随着集约化模式的发展以及水环境的严重恶化,由气单胞菌属(Aeromonas)感染导致的爆发性出血病症状极为严重,该病发病时间短、致死率高,带来了巨大的经济损失,严重的阻碍了水产养殖业的健康发展。本研究拟通过病原物的分离、鉴定及致病性的综合分析,推测其致病机理。在此基础上,将益生菌添加到鱼类饲料中应用到草鱼的养殖生产中,检测益生菌发酵饲料对细菌感染后草鱼的抗病能力,以探讨益生菌作为免疫刺激剂在防御出血性疾病中的作用。主要研究如下:从新乡市某鱼塘采集具有该病病症的草鱼样本,取患病皮肤、肝、脾和肠等组织,经初筛、复筛后得4株纯化的病原菌,16S rDNA的鉴定后分别为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、腐败希瓦氏菌(Shewanella sp.)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。将四种菌株分别对健康草鱼进行回归感染,通过患病症状得出维氏气单胞菌是致草鱼发病的主要菌株,并将其作为目标菌株进行毒性效应的研究。以气溶素、肠毒素和外膜蛋白三种毒力基因作为靶向基因,得出维氏气单胞菌较其他三株菌毒力基因表达明显;将目标菌株对健康草鱼进行急性毒性研究得:96 h半致死浓度为3.6×10~4 CFU/mL,安全浓度为9.11×10~3 CFU/mL。以浓度1.82×10~5、2.81×10~6、1.82×10~8 CFU/mL的菌悬液腹腔注射感染草鱼48 h和以浓度为2.81×10~6 CFU/mL的菌悬液感染24 h、48 h、72 h、96 h,分别提取草鱼各组织器官的总RNA,通过RT-qPCR方法检测IL-8和TNF-α基因表达变化,分析病原菌感染后炎症相关基因与草鱼肠道炎症的关联性,结果表明经病原菌感染后草鱼各组织mRNA水平的IL-8和TNF-α转录水平较对照组均不程度的提高。以浓度1.82×10~5、2.81×10~6、1.125×10~7、1.82×10~8 CFU/mL的菌悬液感染草鱼,检测不同感染时间时血清和肝组织中琥珀酸脱氢酶、溶菌酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶五种指标的变化。结果证明病原菌感染后能使血清中ALT、SDH、lysozyme和AKP酶活力显著提高,同时高浓度组显著高于对照组(p0.05);PK酶活力在感染96h时高浓度组相较对照组酶活力显著降低(p0.05)。肝组织中PK、ALT和AKP酶活力表现出随着感染浓度提高显著提高的现象(p0.05)。以浓度1.82×10~5 CFU/mL的益生菌(保加利亚乳杆菌、枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌)按3%喷洒到普通饲料上,饲喂病原菌感染后的草鱼,结果显示益生菌发酵饲料使病原菌感染后的草鱼肝脏、肾脏和肠道组织中的IL-8表达显著高于饲喂基础饲料(p0.05);同时,肝脏、皮肤、脾脏和肠道组织的TNF-α的表达量显著高于饲喂基础饲料(p0.05)。与对照组相比,饲喂16天时,血清AKP和ALT酶活性显着高于对照组(p0.05);同时,PK、SDH和lysozyme酶活性随着饲喂时间的延长作用不显著(p0.05)。饲喂益生菌发酵料的草鱼死亡率显著低于饲喂基础料组,即益生菌发酵料能显著提高病原菌感染后草鱼的存活率。结果得出益生菌发酵饲料能够提高鱼类抵抗力、降低由病原菌感染的发病率,此结果对于益生菌改善养殖生态环境作用方面提供了良好的参考。天然免疫刺激剂是一个有前景的领域因为它们是可生物降解并且具有生物相容性,同时对环境和人类健康都是安全的。因此益生菌发酵饲料应用于水产养殖中疾病的控制乃至疫苗的开发提供了理论依据,为改善养殖生态环境方面带来了新的方式。
【图文】：

菌株,光学显微镜,同源性,测序

19图2-1 菌株的光学显微镜形态观察Figure 2-1Morphological observation of strains under light microscope2.3.2 分子生物学鉴定和系统发育树的构建4 种菌株经电泳后大小均为 1500bp 左右，将胶回收产物送往上海生工进行测序，测序结果在 NCBI 数据库中进行核苷酸序列的同源性分析，在 MEGA 6.0 分析软件将 4 种菌株的 16SrDNA 序列进行系统分析和比较构建树状图，结果见图 2-2。将测序结果经NCBI 比对得出 1 号菌株与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)同源性达 99%，2 号菌株与为腐败希瓦氏菌(Shewanella sp.)同源性达98%，3号菌株与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)同源性达 98%，4 号菌株杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)同源性达 98%。图 2-2 纯化的病原菌16S rDNA基因序列构建的系统进化树Fi

系统进化树,病原菌,基因序列,菌株

图2-1 菌株的光学显微镜形态观察Figure 2-1Morphological observation of strains under light microscope2.3.2 分子生物学鉴定和系统发育树的构建4 种菌株经电泳后大小均为 1500bp 左右，，将胶回收产物送往上海生工进行测序，测序结果在 NCBI 数据库中进行核苷酸序列的同源性分析，在 MEGA 6.0 分析软件将 4 种菌株的 16SrDNA 序列进行系统分析和比较构建树状图，结果见图 2-2。将测序结果经NCBI 比对得出 1 号菌株与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)同源性达 99%，2 号菌株与为腐败希瓦氏菌(Shewanella sp.)同源性达98%，3号菌株与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)同源性达 98%，4 号菌株杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)同源性达 98%。
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S943

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