【摘要】：斑节对虾(Penaeus monodon)是我国沿海地区重要的水产养殖品种之一。本课题组在近十几年攻克了斑节对虾难以人工繁育的难题,成功实现了斑节对虾的全人工繁育。但对该过程中亲虾的性腺发育和内分泌调控成熟机理了解的不充分,制约了全人工繁育技术的升级。为此,开展基于小肽类激素调控斑节对虾性腺发育机理的研究,将有助于解决上述问题。其中,由脊椎动物下丘脑合成分泌的促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是一种十肽激素,通过与GnRH受体(GnRHR)结合激活相关信号转导通路调控促成熟激素的合成分泌,调控脊椎动物的性腺发育成熟过程。目前已有相关研究已经证明斑节对虾的神经系统中存在GnRH,但其如何与GnRHR共同调控斑节对虾性腺成熟发育的相关研究还比较缺乏,因此本研究通过构建斑节对虾成熟前后卵巢和神经组织的转录组文库了解不同卵巢发育期的基因差异表达变化,从中筛选GnRH及其受体的候选基因;同时采用体外组织原代培养、原核表达GnRH体内注射等方法确定GnRH类似物对斑节对虾性腺成熟发育的调控作用。具体研究结果如下:(1)构建了斑节对虾雌虾卵巢及神经系统的转录组文库收集斑节对虾处于不同发育时期的雌虾样品,利用Illumina Hi SeqTM高通量测序技术构建了雌虾卵巢、神经组织的转录组文库。6个转录组文库共获得了44.63 G的数据,原始序列经聚类组装后产生了246206个transcripts,125806个Genes。与七大数据库进行同源性比对及功能注释后,共发现了7728个Genes可以得到明确注释。在卵巢不同发育阶段的比较转录组中,发现了56个差异表达基因,在不同卵巢发育阶段的神经组织中发现164个差异表达基因,不同时期卵巢及神经组织之间共发现6912个差异表达基因。(2)探究了斑节对虾G蛋白偶联受体基因的功能作用通过转录组文库筛选获得激素受体候选基因:G蛋白偶联受体基因,并对其基因特性及表达特性进行研究。经过生物信息学分析确定,Pm GPCR蛋白具有7个跨膜结构域(7TM)和DRY基序,属于类视紫红质受体家族。系统发育进化树也表明Pm GPCR与Pc GPCR(克氏原鳌虾)汇为一支。实时荧光定量PCR结果显示,Pm GPCR基因在不同发育阶段、蜕皮过程、细菌刺激、氨氮胁迫后表达变化。(3)优化了斑节对虾性腺组织细胞原代培养的条件探索使用三种改良型培养基进行培养并对组织分别进行机械分离和酶消化的培养方法处理后的细胞生长状态及活力、相关基因的表达变化。结果发现机械分离法适用于观察组织变化情况且易于操作,酶消化法适用于观察单个细胞的形态变化、蛋白定位等实验。而通过观察细胞生长的情况及HE染色后性腺组织的切片及三种培养基中的细胞活力值,发现酶解法更适用于斑节对虾性腺细胞的离体培养,1号或2号培养基在特定的培养条件下效果更优于3号培养基,培养时间在3d左右为宜,c-Mos基因的表达情况与斑节对虾离体组织/细胞的生长情况呈正相关。(4)GnRH类似物对体外培养性腺组织/细胞的作用采用离体性腺细胞原代培养的方法研究了章鱼促性腺激素释放激素类似物(Oct GnRH)、克氏原螯虾促性腺激素释放激素类似物(Pc GnRH)、罗氏沼虾促性腺激素释放激素类似物(Mro GnRH),以及多种神经组织对斑节对虾性腺发育的作用效果。结果表明:50 ng·ml-1 Oct GnRH对离体雌雄虾的性腺发育有明显的作用,显著增大卵母细胞的直径(P0.01),50 ng·m L-1 Oct GnRH、500 ng·m L-1 Pc GnRH及脑神经处理后的雌虾离体卵巢的卵黄蛋白原积累量随着培养时间的延长显著增加。因此确定选择章鱼GnRH的序列进行体外重组蛋白的表达。(5)活体注射GnRH类似物对斑节对虾性腺成熟的影响将章鱼GnRH类似物的氨基酸核心序列以多拷贝的形式插入p GEX-2T表达质粒,通过原核表达系统获得可溶性表达的8拷贝(8Oct GnRH-p GEX-2T)及16拷贝(16Oct GnRH-p GEX-2T)的融合蛋白,经GST标签亲和纯化获得纯化的融合蛋白。将8拷贝Oct GnRH、16拷贝Oct GnRH融合蛋白及化学合成的Oct GnRH、Pc GnRH多肽对成熟前期的雌雄斑节对虾进行体内注射实验,结果表明16拷贝Oct GnRH性腺指数在实验到达最后阶段时显著升高。Vg基因的表达规律与斑节对虾的发育成熟规律相符,而GnRHR的表达规律暗示斑节对虾体内可能含有第二种GnRHR,为进一步探究GnRHR的存在奠定了基础,CREB及c-JUN基因的表达规律则反映出斑节对虾体内同样存在GnRH信号转导通路,且调控过程具有多样性和复杂性,需要进行更加深入的研究。
【图文】：
图 1-1 斑节对虾卵巢结构示意图e structure map of ovary of Penae育是同时启动的，，原生殖细胞发境中，卵巢的发育成熟需要 10形态特征的变化将整个过程分）、Ⅲ期（周边核仁期）、Ⅳ期）[4]。具体特征如表 1-1： 1-1 斑节对虾卵巢发育各期特征s of ovarian development at every 颜色 切片观察 无色/白色 卵巢壁较厚，腔大
组织易碎，部分卵母细胞开始重新发育。—1.1.2 雄虾的生殖系统雄虾的生殖系统共包括精巢、输精管、贮精囊及交接器 4 个部分组成（如图1-2）。精巢也为左右两侧对称的结构，左右各有 8 叶，紧贴于心脏和肝胰腺上，未成熟时为透明状，成熟时为半透明的乳白色。精巢内部还含有大量的生精小管，管腔上有生殖带及精原细胞群，后期发育成精细胞。从精巢的尾部两侧各发出一条弯曲折叠的输精管，可分为近端输精管（Proximal vas deferens，PVD）、中端输精管（Middle vas deferens，MVD）和远端输精管（Distal vas deferens，DVD）[5]。近端输精管较细，中端输精管为一段膨大一段纤细的结构，远端输精管整体较细，尤其在靠近贮精囊处会进一步变细，尾部即与壶腹部/贮精囊相连。壶腹部呈椭圆型，成熟时会生长有精荚。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【参考文献】
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本文编号：
2670720
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