拟态弧菌感染黄颡鱼的组织嗜性与动态病理损伤研究

发布时间：2020-05-19 13:50

【摘要】：为研究黄颡鱼感染拟态弧菌(Vibrio mimicus)的病理损伤特征及病原菌在鱼体内的分布规律,以1.0×106 CFU·mL-1浓度菌液浸浴感染黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)30 min,感染后Oh、4h、8h、16h、24h、36h、48h、60 h、72 h剖杀取样,石蜡切片,HE染色观察病理损伤,qPCR检测病原菌在体内的动态分布。结果显示,被感染鱼的主要临床症状为精神沉郁,厌食,体表出血性溃疡,肛门红肿；剖检见鳃与肝点状出血,部分鱼见脾、肾肿大,肝脏苍白色,淡红色腹水,腹膜出血,鳃丝苍白。病理组织学上,皮肤肌肉、鳃、肠道出现病变时间最早,其中皮肤肌肉病变最为严重。16h表皮坏死脱落,真皮轻度出血,鳃丝出血,肠绒毛水肿；24-48h真皮严重出血,肌间隙增宽,炎症细胞浸润,肌纤维变性、坏死；鳃丝毛细血管扩张淤血、出血,上皮细胞肿胀,局部坏死,脱落,肠黏膜上皮与固有膜灶性分离；48-72h表皮与真皮层坏死,脱落,其下肌纤维溶解坏死,其内见多量病原菌：鳃小片毛细血管出血,上皮细胞灶性水肿浮离或坏死脱落；感染后36 h肾脏出现淤血,与肾小球肿大,肝、脾、肾与心48 h后出现不同程度的淤血、出血,变性,局灶性的坏死和炎症细胞浸润。病原菌的qPCR检测显示细菌首先出现于鳃、肠与皮肤,感染后4h即在鳃、肠道、皮肤肌肉中检测到细菌,检出量分别为1.3×102 CFU·mg-1,2.6×102 CFU·mg-1,4.7×102 CFU·mg-1。肠道中带菌量随后逐渐降低,而鳃与皮肤肌肉中细菌含量随感染时间延长而增加,72 h鳃中细菌含量达到4.7×103 CFU·mg-1,皮肤肌肉中细菌含量达到4.5×107 CFU·mg-1,其含量显著高于其他器官。感染后24 h肾脏中检测出病原菌,感染后36 h肝、脾、心中检测出病原菌,随感染时间延长含量逐渐升高,菌量介于1.9×101～4.7×102 CFU·mg-1之间,脑中未检出病原菌。qPCR检测结果与组织损伤进程基本一致,表明拟态弧菌首先粘附于黄颡鱼肠道,皮肤肌肉和鳃,同时可侵染多数内脏器官,但主要于皮肤肌肉内进行繁殖。免疫组织化学法对皮肤肌肉中的细菌进一步定位发现,病原菌主要分布于皮下疏松结缔组织层与骨骼肌肌纤维上。
【图文】：

图２、３－Ａ）

血素,拟态,条带,基因

３．３溶血素基因（Ｖｍｈ）的扩X楀义狭街昴馓【卸汲晒┰龀瞿康奶醮笮∥欤希希猓鹱笥遥跣晕椿棥＃ḿ迹担╁义希停戾危插危冲义希鼕皱义希保保保痹灿臑担桑桑桑伞义贤迹德逖鼗颍郑恚杼匾旎蔚睦┰鎏醮笮。保盎疱义希停玻埃ǎ模危粒恚幔颍耄澹颍浚馓!ＤＮＡ１号、２粗、态弧茵ＤＮＡ：＂４、３．阴件－对照．逡逑Ｆｉｇ邋５邋Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ邋ｇｅｎｅ邋ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｂａｎｄｓ邋１０６邋ｂｐ．逡逑Ｍ．２００邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ、１．邋Ｎｏ．邋１邋ｖｉｂｒｉｃＭｒＨｍｉｃｕｓ邋ＤＮＡ、：邋Ｎｏ邋２邋ｖｉｂｒｉｏ邋ｍｉｍｉｃｕｓ邋ＤＮＡ、３．邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｍｒｏＬ逡逑３．４邋Ｖｍｈ的Ｔ克隆及ＰＣＲ鉴定逡逑扩增出的目的片段经胶回收，转化子ＤＨ５ａ感受态细胞，后禹ｔ选氨韦抗性菌株１０逡逑株进行菌落ＰＣＲ初步鉴定。经菌落ＰＣ民鉴定，挑选的１０株氨节抗性单菌落，其中８逡逑为阳性克隆茜。挑选一株阳性克隆菌，ＬＢ肉汤３７°Ｃ培养过夜后，提取质粒。利用逡逑ＶｍＨ和Ｍ１３两对引物进行ＰＣＲ反应，结果显示ＶｍＨ扩增引物条带大小在ｌＯＯｂｐ左逡逑右，Ｍ１３扩增条带大小在２００ｂＰ左右，说明特异性片段成功连接至ＰＭＤ１８－Ｔ载体上。逡逑（见图６）逡逑Ｍ逦】逦三逡逑逦逡逑Ｌ．逡逑图６质粒为横板
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S943

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