RPA在水产病毒病原检测中的应用及毛蚶疱疹病毒流行病调查
发布时间：2020-05-20 12:38
【摘要】：鲍疱疹病毒(Abalone Herpes Virus,AbHV),赤点石斑鱼神经坏死病毒(Redspotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)和牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1,OsHV-1)是对水产养殖动物危害较严重的3种病毒,目前没有有效的治疗方法。海水养殖病害防控“以防为主”。国内外在水产疫病诊断技术方面,已经建立了各种常见水产疫病病原的检测方法,如PCR、qPCR、LAMP、抗原抗体检测、核酸杂交检测等。本研究针对上述3种病毒分别设计了合适的引物和探针,用荧光定量重组酶聚合酶扩增(Quantitative Recombinase polymerase amplification,qRPA)的方法进行检测,通过与荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)比较来评估qRPA试验方法的灵敏度和特异性。结果显示:qRPA对AbHV检测的灵敏度为100拷贝,反应时间仅为20±0.50分钟;在对疑似感染AbHV的杂色鲍(Haliotis diversicolor)样品进行检测时,qRPA和qPCR对AbHV的检测率分别为96%和93%。qRPA对RGNNV检测的灵敏度为100拷贝,反应时间为20±0.50分钟;检测疑似感染RGNNV的石斑鱼(Epinephelussp)样品时,qRPA和qPCR对RGNNV的检测率分别为97%和95%。在对OsHV-1进行检测时,以ORF95为模板设计的引物和探针可以检测到5拷贝的DNA,远高于本研究所采用的qPCR检测的灵敏度(100拷贝);qRPA和qPCR检测疑似感染OsHV-1的毛蚶(Scapharca subcrenata)样品时,对OsHV-1的检测率都是22%。另外,利用qPPA和qPCR分别对感染三种病毒的样品进行验证时,检测结果之间均呈现出较好的相关性,R~2均大于0.8。Whatman FTA卡是一种可以在室温下对各种生物样品进行收集、运输、存档和核酸纯化的滤膜设备。本研究使用FTA卡提取感染GNNV的石斑鱼脑组织中的RNA,运用RT-PCR方法成功检测出了RGNNV。这种提取方式大大简化了病毒提取的步骤,节约时间和成本。为了使检测结果可视化,本研究中还尝试了用RPA结合横向流动试纸条(Lateral flow dipstick,LFD)的方法检测AbHV、RGNNV和OsHV-1,并验证该方法的灵敏度。3种病毒阳性质粒的反应时间为5 min时,LFD对它们的检测限分别是10拷贝、10拷贝、100拷贝。本研究还利用qPCR方法检测了15个沿海城市的毛蚶样品中的OsHV-1感染情况,对毛蚶中OsHV-1的地域分布以及感染率的情况有了深入了解。流行病调查结果显示,除了深圳、大连、连云港和南通地区采集的毛蚶检测到OsHV-1外,其他地区均未检测到该病毒。
【图文】：
图 1-1 从 2000-2017 年，web of science 上收录的各种等温扩增技术的文献数ig.1-1 From 2000 to 2017 year, the number of articles on various isothermal amplificationincluded in the web of science通过统计在 Web of Science 收录的有关等温扩增的文献数（图 1-1），可 LAMP 是近几年应用最多的一种等温扩增技术。同时也发现，RPA 是另具有很大潜力的检测技术，近几年逐渐在生科科学、食品安全等检测领域角。虽然相对其他几种检测方法，，该技术问世较晚，但却是近年来生命科研究的热点。下面就这两种技术的反应原理及其应用情况进行探讨。LAMP 研究进展 扩增原理LAMP 技术主要是通过设计两条特异的外部引物和两条特异的内部引物
引物特异性检测电泳图。1-8：阴性对照，阳性对照，卵形鲳湽基因组DNA，感染 WSSV 的南美白对虾的基因组 DNA，东风螺基因组 DNA，菌基因组 DNAecificity assays of RPAdetection. lane 1-8: negative control, positive controachinotus ovatus, genomic DNAof Crassostrea gigas, genomic DNA of Peinfected with WSSV, genomic DNA of Babylonia areolata, water DNA anderomonas hydrophila. 检测 AbHV 的灵敏度和重复性质粒标准品经10倍梯度稀释，选取 107~10的稀释浓度进行q曲线。以重组质粒拷贝数对数值为 X 轴，以 Ct 值为 Y 轴，得式为 Y = －4.38X + 33.49，如图 2-2 所示，该标准曲线的相关2）为 0.9036，扩增效率（E）为 100%。为了验证试验批次间
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S941.41
本文编号：2672633
【图文】：
图 1-1 从 2000-2017 年，web of science 上收录的各种等温扩增技术的文献数ig.1-1 From 2000 to 2017 year, the number of articles on various isothermal amplificationincluded in the web of science通过统计在 Web of Science 收录的有关等温扩增的文献数（图 1-1），可 LAMP 是近几年应用最多的一种等温扩增技术。同时也发现，RPA 是另具有很大潜力的检测技术，近几年逐渐在生科科学、食品安全等检测领域角。虽然相对其他几种检测方法，，该技术问世较晚，但却是近年来生命科研究的热点。下面就这两种技术的反应原理及其应用情况进行探讨。LAMP 研究进展 扩增原理LAMP 技术主要是通过设计两条特异的外部引物和两条特异的内部引物
引物特异性检测电泳图。1-8：阴性对照，阳性对照，卵形鲳湽基因组DNA，感染 WSSV 的南美白对虾的基因组 DNA，东风螺基因组 DNA，菌基因组 DNAecificity assays of RPAdetection. lane 1-8: negative control, positive controachinotus ovatus, genomic DNAof Crassostrea gigas, genomic DNA of Peinfected with WSSV, genomic DNA of Babylonia areolata, water DNA anderomonas hydrophila. 检测 AbHV 的灵敏度和重复性质粒标准品经10倍梯度稀释，选取 107~10的稀释浓度进行q曲线。以重组质粒拷贝数对数值为 X 轴，以 Ct 值为 Y 轴，得式为 Y = －4.38X + 33.49，如图 2-2 所示，该标准曲线的相关2）为 0.9036，扩增效率（E）为 100%。为了验证试验批次间
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S941.41
【参考文献】
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1 杨蕊;姜敬哲;王江勇;赵旺;;杂色鲍低温病毒病研究进展[J];广东农业科学;2013年02期
2 汪琳;罗英;周琦;赖平安;柏亚铎;;核酸恒温扩增技术研究进展[J];生物技术通讯;2011年02期
3 林蠡,黄剑南,翁少萍,王云新,刘付永忠,张海发,何建国;赤点石斑鱼病毒性神经坏死症的组织病理和电镜观察[J];水产学报;2005年04期
4 陈晓艳;鱼类病毒性神经坏死病研究现状[J];动物医学进展;2005年05期
本文编号：2672633
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