斑节对虾miR-145与miR-454介导的TRIAP1应答哈维弧菌胁迫的作用机制研究

发布时间：2020-05-25 03:32

【摘要】：斑节对虾(Penaeus monodon)具有口味出众、营养丰富、生长发育快的特点,在东南亚和我国南方是最具商业价值的物种之一。近年来因为环境压力越来越大,导致感染斑节对虾的情况越来越严重,致使斑节对虾的养殖产业受到严重打击。其中哈维弧菌(Vibrio harveyi)是一种广泛存在于海洋环境中的可以感染甲壳类、鱼类、贝类的致病菌,易引发突眼、慢性皮肤溃疡、败血症等动物病症。研究发现致病菌感染可引起斑节对虾发生细胞凋亡。miRNA是调控基因表达的重要因子,在细胞凋亡调控中发挥重要作用。肿瘤蛋白p53调控的凋亡抑制因子(TRIAP1)可通过抑制细胞凋亡参与体内免疫反应,其基因表达受miRNA调控。本研究通过RACE技术克隆了斑节对虾TRIAP1基因cDNA全长;确定了斑节对虾TRIAP1基因(PmTRIAP1)在不同组织中的表达模式;对靶向调控PmTRIAP1的miRNA进行了筛选,并利用双荧光素酶报告实验验证其作用靶位点;利用荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白免疫印迹法(Western Blot)等方法研究了斑节对虾在哈维弧菌应激情况下血细胞中miR-454、miR-145对PmTRIAP1基因表达调控的影响;初步掌握了由哈维弧菌应激所产生的细胞凋亡与miR-454、miR-145及PmTRIAP1之间的关系,具体研究内容如下:(1)斑节对虾中的PmTRIAP1的全长cDNA序列共2522 bp,包含11 bp的5'-UTR,2289 bp的3'-UTR,222 bp的ORF,共编码73个氨基酸,分子量为8.6kDa,理论等电点(PI)为4.9。PmTRIAP1在所有检测的组织中都有表达,在血细胞中的表达最高,是卵巢中的18.58倍,其次在肝胰腺和肠中表达较高,分别是卵巢的4.37倍和3.49倍,在胸神经中表达量最低。序列比对结果显示,斑节对虾中的TRIAP1与柑橘木虱(Diaphorina citri)TRIAP1的相似度最高为61%,在进化上保守性较高。(2)miRNA的筛选:为了找出与PmTRIAP1-3'UTR结合的miRNA,使用Mireap、Miranda、Targetscan软件共同进行预测得到16种潜在调控PmTRIAP1的miRNA。当斑节对虾受到哈维弧菌刺激时,miR-145、miR-454的相对表达量在6 h、24 h、48 h、72 h均有显著上调。PmTRIAP1的相对表达量在24、48、72h显著下降,miRNA的表达与PmTRIAP1的表达呈负相关。双荧光素酶报告结果显示,miR-454可以调控PmTRIAP1基因3'UTR的荧光素(luciferase)表达(p=0.0047);而在结合位点突变后未检测到luciferase活性显著变化。miR-145可以调控带有PmTRIAP1 3’UTR的luciferase的表达;而在结合位点突变后未检测到luciferase活性显著变化。miR-145和miR-454可以调控带有PmTRIAP1 3'UTR的luciferase的表达(3)miRNA与PmTRIAP1调控关系研究:分别注射miR-145、miR-454的类似物过表达miRNA和注射miR-145、miR-454的抑制物沉默miRNA。过表达miR-145后可在24 h和48 h降低斑节对虾血细胞中PmTRIAP1的相对表达量,分别下降0.82和0.54倍;过表达miR-454后可在24 h降低斑节对虾血细胞中PmTRIAP1的相对表达量;沉默miR-145可在24 h和48 h增加斑节对虾血细胞中PmTRIAP1的相对表达量,沉默miR-454可在24 h和48 h增加斑节对虾血细胞中PmTRIAP1的相对表达量。通过TUNEL法检测细胞凋亡发现:在过表达miR-145和miR-454的第24 h斑节对虾血细胞的细胞凋亡相较对照组增多;在沉默miR-145和miR-454后的第24 h斑节对虾血细胞的细胞凋亡相较对照组减少。miR-145和miR-454可通过调节PmTRIAP1的表达调控斑节对虾血细胞的细胞凋亡。(4)哈维弧菌刺激下,miR-454、miR-145对PmTRIAP1和细胞凋亡的影响:斑节对虾受到哈维弧菌刺激后,使用siRNA干扰PmTRIAP1基因的表达可显著降低斑节对虾血细胞中TRIAP1蛋白的表达量;过表达斑节对虾miR-145(注射miR-145-agomir)6 h、24 h、48 h后其血细胞中PmTRIAP1的相对表达量显著下调;过表达斑节对虾miR-454(注射miR-454-agomir)6 h、24 h后其血细胞中PmTRIAP1的相对表达量显著下调;沉默斑节对虾miR-145(注射miR-145-antagomir)6 h、24 h、48 h后其血细胞中PmTRIAP1的相对表达量显著上调;沉默斑节对虾miR-454(注射miR-454-antagomir)6 h、24 h后其血细胞中PmTRIAP1的相对表达量显著上调。通过TUNEL法检测发现,斑节对虾受到哈维弧菌刺激后干扰PmTRIAP1基因的表达或过表达miR-145或miR-454,均会增加斑节对虾血细胞的细胞凋亡程度;抑制miR-145和miR-454表达会减轻斑节对虾血细胞的细胞凋亡程度。以上结果表明,在哈维弧菌刺激下,miR-145和miR-454通过负向调控PmTRIAP1影响斑节对虾血细胞的细胞凋亡。
【图文】：

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图 1-1 TRIAP1 参与细胞凋亡的过程Fig 1-1 Process of TRIAP1 involved in apoptosis1.4 miRNA 简介MicroRNA（miRNA）是类长约 18~25 个核苷酸的内源性非编码小 RNA分子。miRNA 在细胞核内由 RNA 聚合酶 II 或 III（polymerases II or III）转录形成具有多聚腺苷酸（polyA）尾巴和帽子结构的 pri-miRNA[32, 33]。pri-miRNA 在DroshaRNase 和它的辅助因子双链 RNA 结合蛋白（DGCR-8）的共同作用下被剪切成 70 nt 具有茎环结构的 miRNA 前体（pre-miRNA）[34, 35]。在细胞质中 pre-miRNA被RNaseII（IDicer 酶）进步加工成21-25个核苷酸长度的双链miRNA，随后与沉默复合体（RNA inducing silencing complex）结合并连接到 Argonaute（AGO）蛋白上，AGO 蛋白展开双链 miRNA 并保留成熟的 miRNA。成熟的miRNA 可以与靶基因以两种不同机制相互作用（完全匹配或者种子序列匹配）调控目的基因翻译或降解靶 mRNA 和新合成的多肽链[32,36,37]。成熟的 miRNA 与

系统进化树

图 2-2 PmTRIAP1 系统进化树使用 Clustal X 进行多重序列比对后用 MEGA7.0 构建 NJ 进化树。相关 TRIAP1GenBank 注册号如下：褐鼠：NP_001119571.1，智人：NP_057483.1，黄牛：NP_001073244.1，，家鸡：NP_001264437.1，密西西比鳄：XP_006259200.1，热带爪蟾：NP_001016268.1，高山蛙：XP_018412920.1 斑马鱼：NP_001153292.2，墨西哥脂肪鲤：XP_007250308.1，柑橘木虱：XP_008467959.1，埃及伊蚊：NP_001073244.1，果蝇：XP_002063899.1，斜纹夜蛾：XP_022814144.1Fig.2-2 Phylogenetic analysis of PmTRIAP1Alignment of amino sequences was produced by Clustal X, and the bootstrap neighbor-joiningphylogeny tree was constructed by MEGA 6.0.GenBank acession numbers encoding TRIAP1 aras follows:Rattus norvegicus: NP_001119571.1, Home sapiens: NP_057483.1, Bos taurus:NP_001073244.1, Gallus gallus: NP_001264437.1, Alligator mississippiensis: XP_006259200.Xenopus tropicalis: NP_001016268.1, Nanorana parkeri: XP_018412920.1, Danio rerio:NP_001153292.2, Astyanax mexicanus: XP_007250308.1, Diaphorina citri: XP_008467959.1Aedes aegypti: NP_001073244.1, Drosophila willistoni: XP_002063899.1, Spodoptera litura:
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S945.4

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