鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25蛋白单克隆抗体的制备和鲤TRIM25基因的克隆与序列分析

发布时间：2020-06-02 01:14

【摘要】：鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2),是一种感染鲫(Carassius auratus)、金鱼(Carassius auratus)、及鲤与金鱼杂交体的高致病性病毒,CyHV-2首次发病是在日本养殖的金鱼中;2011、2012年,Wang等首次报道了CyHV-2可感染养殖鲫,造成了我国异育银鲫(Carassius auratusgibelio)的大规模死亡。2013年,武汉、广州、江苏等地也报道了该病的暴发,自发病异育银鲫中检测到CyHV-2。目前控制该病仍缺乏有效的药物和方法,因此,迫切需要研制并建立ELISA等免疫学快速检测方法,为该病的临床诊断及检测提供有效工具。本研究通过克隆CyHV-2具有良好抗原特性的膜蛋白ORF25基因部分片段,并将扩增产物连接到原核表达载体pGEX-KG上,成功构建了CyHV-2-ORF25-KG重组质粒。IPTG将其诱导后,SDS-PAGE分析表明:目的蛋白得到表达,分子量大小为42 KDa,且主要表达在包涵体中。用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,多次免疫后通过细胞融合,筛选出一株单抗5C6;经间接免疫荧光试验和Western Blot试验验证,这株单抗可以特异性的识别CyHV-2 ORF25蛋白。本实验通过制备CyHV-2ORF25蛋白的单克隆抗体,为研究CyHV-2的致病机理及检测方法的建立奠定了基础。为了克隆和表达鲤TRIM25,本研究提取鲤卵巢组织总RNA,以反转录获得的cDNA为模版,通过PCR方法扩增了TIRM25编码区全长,序列分析发现,鲤TRIM25与斑马鱼及朝鲜溠湉的氨基酸同源性较高,遗传进化分析也聚为一支;进一步将其克隆至真核表达载体pCDNA4.0中,构建了重组质粒pCDNA4-TRIM25,将该重组质粒分别转染HEK293T细胞与FHM细胞,经间接免疫荧光、Western Blot检测,证明TRIM25蛋白在HEK293T细胞和FHM细胞中获得表达。该研究为鲤TRIM25的功能研究奠定了基础。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S941.4

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本文编号：2692367