日本沼虾衔接蛋白Syntenin和ADP核糖基化因子2基因的分子克隆及其表达分析

发布时间：2020-06-02 01:18

【摘要】：日本沼虾(Macrobrachium nipponinse)是我国淡水养殖中重要的经济虾类之一。随着集约化的养殖,环境胁迫成为日本沼虾养殖过程中的关键问题,而氨氮是水产养殖中最重要的环境胁迫因子之一,能够严重影响水产动物生长发育与生理健康。因此研究日本沼虾抗氨氮胁迫的分子机制尤为重要。衔接蛋白Syntenin(MnSyn)是普遍存在于真核生物及原核生物中的胞内衔接蛋白(adaptor proteins),在细胞免疫和信号转导等细胞活动中发挥重要作用。ADP核糖基化因子2(MnArf2)是Ras基因超家族中的成员,能够调节磷脂酶D的活性,在物质运输和信号转导过程中发挥重要作用。本试验以日本沼虾为实验材料,采用RACE克隆、实时荧光定量PCR、Western blot和酶活测定等技术,对MnSyn、MnArf2基因进行了克隆鉴定和基因表达与功能检测,同时对高浓度氨氮胁迫下日本沼虾抗氧化酶的相关变化进行了测定。主要研究结果如下:首先在实验室条件下,通过对日本沼虾进行氨氮胁迫试验得到其半数致死浓度LD50(48h)为96.8mg/L。酶活性测定显示,氨氮胁迫初期日本沼虾肝胰腺、鳃和肌肉组织的总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)均出现显著的上升趋势。在胁迫后期T-AOC和SOD出现明显的下调,说明机体的抗氧化酶活性受到明显的抑制。丙二醛(MDA)的含量在胁迫初期无明显变化,胁迫24h后MDA的水平显著高于对照组,且出现逐渐上升的趋势,表明日本沼虾的组织细胞受损程度逐渐严重。通过分子克隆和RACE技术,获得了长度为2432bp的日本沼虾MnSyn基因cDNA全序列。其中包含62bp的5′UTR、1475bp的3′UTR和957bp的CDS区,其中开放阅读框编码为318个氨基酸组成的蛋白质,预测该蛋白分子量为34.26KDa。该基因编码的蛋白质有两个串联存在的PDZ结构域。同源性比较分析发现MnSyn与凡纳滨对虾、斑节对虾和日本囊对虾Syntenin基因的相似性均较高,分别依次是78%、77%和75%,在进化过程中比较保守。日本沼虾MnArf2基因全长为949bp,包含264bp的5′UTR、148bp的3′UTR以及537bp的CDS区,其中537bp开放阅读框编码为178个氨基酸组成的蛋白质,预测该蛋白分子量为19.98KDa。序列比对分析发现,MnArf2与日本对虾Arf相似性70%,与凡纳滨对虾Arf-like相似性69%。MnArf2含有典型的Switch、Interswitch区和Ploop区。Switch、Interswitch区参与调节Arf分子在GDP/GTP间相互转化,这些结构均能够反映出MnArf2在进化上是高度保守的。荧光定量检测结果显示,在氨氮胁迫后的8个时间点(0h,3h,6h,12h,24h,48h,72h,96h),日本沼虾MnSyn基因和MnArf2基因在各组织的表达量均发生了明显的变化。氨氮胁迫6h后MnSyn基因的表达量开始上升,在24h处表达量达到峰值,之后开始下降,72h后仍与对照组有显著差异。MnArf2在氨氮胁迫后6h表达量显著上调,胁迫12h处达到峰值,之后开始下调,72h后逐渐恢复到初始水平。Western Blot结果表明,MnSyn蛋白在日本沼虾的肝胰腺、鳃、肌肉、心、胃和眼柄中均有表达。且在肝胰腺和鳃组织中的表达量最高,眼柄和胃组织中的表达量较低,差异显著(P0.05)。综合分析试验结果,氨氮胁迫后日本沼虾MnSyn和MnArf2基因均出现显著的上调表达,在肝胰腺、鳃以及心组织中表达量较高,表明MnSyn和MnArf2基因与日本沼虾受氨氮胁迫产生的免疫应答反应有关。本研究为进一步揭示日本沼虾抗氨氮胁迫的分子机制奠定了重要基础,同时也为日本沼虾的健康养殖提供了科学依据。
【图文】：

细胞的,超氧化物歧化酶,过氧化物,甲壳动物

图 1.1 活性氧分子对细胞的损伤（Nordberg &Arnér, 2001）Fig. 1.1The damaga of ROS to cell (Nordberg &Arnér, 2001)壳动物为了减轻活性氧分子给机体带来的损伤，在自身的进化过程中产生作用的酶。这些酶能够迅速的通过氧化还原作用将在体内形成的过氧化物物质（Cerutti, 1985）。常见的抗氧化酶有超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和酶等。超氧化物歧化酶的特点是含有金属结构的一类酶，根据结合金属离 Fe/ZnSOD、Cu/ZnSOD、FeSOD、NiSOD 和 MnSOD 五中超氧化物歧化andalios, 2002; Lin et al., 2008）。超氧化物歧化酶能够在呼吸爆发后使超氧歧化反应，转化为的氧气和过氧化氢。过氧化物还原酶是一种能够还原过是甲壳动物体内必不可少的一种抗氧化酶。过氧化物还原酶分布在细胞核胞器和细胞质溶胶中（Kim et al., 2005; James et al., 2010）。甲壳动物体内酶能够联合发生作用，保证了机体不受活性氧分子的伤害，从而维持机体动。

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图 3.1 日本沼虾肝胰腺总 RNA 电泳条带Fig. 3.1 The total RNAagarosegel electrophoresis of Macrobrachium nipponensen 基因试验结果n 基因 cDNA 的克隆及序列分析沼虾肝胰腺反转录的 cDNA 为模板，用自行设计的上下游引 MnSyn 基因，得到该基因的中间片段。进一步跟据中间片段的特异性引物SY5-R1 和SY5-R2，以及3′RACE特异性引物SY3-RNAMAN 8.0 和 Chroma 等软件处理拼接后得到基因的 cDNA 全A 序列全长为 2432bp，，包含 62bp 的 5′UTR、1475bp 的 3′UTCDS 区编码 318 个氨基酸，预测分子量（Mw）为 34.26KDa，在线预测软件分析显示，MnSyn 包含 PDZ1 和 PDZ2两个串联存 3.2）
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

【参考文献】