基于高通量测序的功能微生物分析及其在对虾白斑综合症病毒载体疫苗构建中的应用

发布时间：2020-06-04 03:15

【摘要】：微生物作为自然生态系统中的重要组成部分,在动物体,植物体、及其他自然环境中普遍存在,其对于维持自然环境的生态平衡和宿主的生理功能具有重要意义。因此,关于环境微生物多样性及其功能的研究已经成为微生物学的研究热点。由于常规培养技术的限制,目前在自然生态系统的各个环境中可用于分离培养的微生物不足1%,因此不依赖于分离培养的分子生物学方法在环境微生物学研究中得到了广泛的应用。然而,目前此类方法的研究重点大多局限于环境微生物类群多样性的分析,而对与环境或宿主功能直接相关的特定功能菌群的挖掘与分析还相对较少。因此,为了更好地探究高通量测序技术在功能微生物挖掘分析方面的应用效果,本文首先通过采用高通量测序技术对动物肠道益生菌群中细菌16S rRNA基因V3-V4高变区和冬虫夏草中真菌rRNA基因ITS2区进行测序分析;然后,结合对对虾肠道细菌菌群的分析结果及对虾白斑综合症病毒的研究现状,对对虾肠道细菌菌群进行了分离,同时筛选合适的载体启动子,以从对虾肠道内分离到的优势菌群肠杆菌作为载体菌株进行对虾白斑综合症病毒细菌载体疫苗的构建。主要研究结果如下:(1)采用高通量测序技术对羊粪样品中的芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)和双歧杆菌(Bifidobacterium)进行属水平测序分析,测序得到了大量的目的菌群序列,在97%的相似水平上将其归类得到1922~63172不等的OTUs,样品覆盖率分别为0.89、0.99和1.00,Bacillus(芽孢杆菌属)(37.90%)、Clostridium(梭菌属)(52.50%)和Bifidobacterium(双歧杆菌属)(99.32%)均被检测出来且为主要的优势菌群。(2)对冬虫夏草虫体和子座中的真菌类群进行高通量测序分析得到了大量的目的菌群序列,在97%的相似水平上将其归类得到75~187不等的OTUs,样品覆盖率均为1.00。在虫体和子座中存在大量的共有菌群和各自特有菌群,Ophiocordyceps(线孢虫草菌属)(61.51%、5.30%)和Mortierella(被孢霉属)(26.86%、5.91%)为主要优势共有菌群,此外Tolypocladium(弯颈霉属)、Paecilomyces(拟青霉属)和Metarhizium(绿僵菌属)等也被检测出来并大多为共有菌群。(3)根据上述高通量测序技术在不同样品中微生物类群的分析效果,结合对虾肠道细菌的高通量测序结果显示γ变形菌纲的Enterobacteriaceae(肠杆菌科)(85%)类细菌是对虾各个生长时期的肠道主要优势细菌,本实验对其肠道细菌进行了分离培养,结果表明分离到的肠道细菌有81%归属于肠杆菌科。(4)通过采用四种不同的铁调控型启动子(fur promoter)与噬菌体PhiX174裂解酶基因E(lysis E)进行基因重组与蛋白表达的结果显示,本次实验构建的细菌菌蜕疫苗及载体启动子的筛选未达到预期的结果,需要进一步筛选影响特定毒力蛋白表达的启动子。(5)结合对对虾肠道优势菌群的分析分离结果以及合适启动子的筛选结果,本实验选用组成型启动子J23100、丁香假单胞菌冰核蛋白N端基因序列inaK-N和对虾白斑综合症病毒(WSSV)的囊膜蛋白VP28基因序列进行重组构建表达载体pJIVP28,以从对虾肠道中分离到的优势肠杆菌为载体菌株构建WSSV载体疫苗,结果显示该重组表达载体构建成功,WSSVVP28 ELISA试剂盒也检测出重组蛋白表达并具有良好的活性,并且在宿主菌中也稳定表达。综上所述,本论文的结果表明:在动物肠道中存在大量的功能菌群,采用特异性测序分析方法有助于对其进行深度挖掘和开发;冬虫夏草的自然资源枯竭,人工种植难度较大,以往研究中仅用一种菌导致虫草子实体培养失败,通过对比蛹虫草中Cordyceps(虫草菌属)(99%)测序结果可以推断虫草子实体的形成很可能由两种菌共同形成的,这对于虫草菌的分离培养及人工种植具有重要意义;对虾白斑综合症病毒(WSSV)是一种肠道感染病毒,通过分析对虾不同生长时期的肠道菌群变化,对其优势菌群进行分离培养,并以此作为载体菌株构建相关载体疫苗对对虾类水产动物养殖业的发展具有重要意义。
【图文】：

示意图,白斑杆状病毒,基因组,核衣壳蛋白

6图 1-1 中国株白斑杆状病毒基因组示意图[51]Fig.1-1 Circular representation of the WSBV genome from China[51]1.3.5WSSV 的蛋白质组学作为病毒结构中重要的组成成分，病毒蛋白不仅能维持病毒基本构型、保护病毒的核酸物质，还能在病毒入侵细胞的过程中对组织和细胞进行识别、吸附和侵入。根据病毒蛋白的功能将其分为结构蛋白（主要包括核衣壳蛋白、囊膜蛋白和被膜蛋白）和非结构蛋白[56]。通过采用病毒全基因组序列信息及蛋白质 N 端测序[57-59]等蛋白质组学技术，到目前为止已经鉴定的蛋白有 40 多种[59,60]，其中包括23个囊膜蛋白和9个核衣壳蛋白[61]（如下表1-1），主要核衣壳蛋白有VP15、

芽孢杆菌属,羊粪,芽孢杆菌科,系统发育分析

次之；在科分类层级上，（芽孢杆菌科）（41.27%（7.05%）、Paenibacillaceae科）（0.13%）次之；在能够归类到Lysinibacillus （赖氨酸芽孢杆菌属）（属）（14.80%）， Bifidobacterium芽孢杆菌属）（1.40%）,（苏黎世杆菌属）（0.10%广东药科大学硕士研究生毕业论文Planococcaceae（游动球菌科）（47.45%）和）为主要优势科类，Bifidobacteriaceae（双歧杆菌科）（类芽孢杆菌科）（1.23%）和 Clostridiaceae）次之；在能够归类到属的 OTUs 中，Bacillus（芽孢杆菌属）（15.60%），Sporosarcina（芽孢八叠球菌（双歧杆菌属）（5.80%）, SolibacillusPaenibacillus（类芽孢杆菌属）（1.20%），）和 Clostridium（梭菌属）（0.1%）（图 2Bacillaceae（梭菌37.90%），，（土壤Turicibacter2-1，图 2-2）。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S945.4

【参考文献】