两种鱼源病原菌可视化LAMP及其核酸试纸条检测方法的建立与应用

发布时间：2020-06-04 13:13

【摘要】：类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)广泛分布于水环境和动物体,是一种人、兽以及多种水生动物的肠道病原菌,可通过水、鱼及贝类感染给人,可引起人类感染性腹泻和食物中毒。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是一种常见的条件致病菌,其对鱼类也能感染致病,对水产养殖造成很大威胁。目前类志贺邻单胞菌、肺炎克雷伯菌的检测方法大都依赖专业技术人员操作和昂贵的仪器设备,限制了其在水产养殖基层快速诊断的应用。因此,建立快速、简便的类志贺邻单胞菌和肺炎克雷伯菌检测技术已成为了未来的发展趋势。本研究建立了依赖钙黄绿素和核酸试纸条的可视化环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),以利于在水产养殖基层分别对类志贺邻单胞菌和肺炎克雷伯菌检测。主要内容如下:1.分别从发病杂交鳢和乌鳢病灶处分离到菌株FS170522和ZS685683,经过细菌形态学、生理生化鉴定、16S rDNA基因序列分析,进一步构建了系统发育树确定菌株FS170522为类志贺邻单胞菌,菌株ZS685683为肺炎克雷伯菌。人工感染试验结果显示,菌株FS170522对供试的杂交鳢有较强致病性,LD_(50)为7.5×10~4 CFU/g。菌株ZS685683可致健康乌鳢患病,且人工感染症状与自然感染相同,并从人工感染患病乌鳢体内再次分离到该病原菌,LD_(50)为1.4×10~5 CFU/g。药敏试验结果显示:菌株FS170522对氨苄西林和头孢拉定等抗生素耐药;菌株ZS685683对复方新诺明、克林霉素、麦迪霉素、哌拉西林等抗生素耐药。2.以类志贺邻单胞菌和肺炎克雷伯菌为研究对象,根据GenBank上注册的类志贺邻单胞菌hugA基因序列和肺炎克雷伯菌FimK基因序列,采用LAMP在线引物设计软件Primer Explorer V4及Lasergene7.0 Primer Select进行了引物设计及筛选。分别hugA基因重组质粒和FimK基因重组质粒作为标准DNA模板,将环介导等温扩增技术同钙黄绿素做荧光指示相结合,优化反应温度和时间及反应体系,分别建立了类志贺邻单胞菌和肺炎克雷伯菌可视化LAMP快速检测方法;同时,结合核酸试纸条检测技术,分别实现了针对这两种病原菌的LAMP核酸试纸条检测。研究结果表明,针对类志贺邻单胞菌和肺炎克雷伯菌分别建立的两种LAMP检测方法特异性强,且能在64℃下50 min内完成DNA扩增,钙黄绿素可视化LAMP及其核酸试纸条检测技术针对靶基因的检测下限均为20拷贝/反应(copies/reaction),比传统PCR敏感100倍。进一步应用建立的两种方法对临床病料进行检测,结果表明,可视化LAMP及其核酸试纸条方法对临床疑似病料的检出率均高于普通PCR的检出率。本研究分别建立的钙黄绿素可视化LMAP及其核酸试纸条检测技术具有操作简单、检测快速准确、检测成本低等优点,可应用于类志贺邻单胞菌和肺炎克雷伯菌的现场快速检测中。
【图文】：

图 1-2 全封闭式靶核酸扩增快速检测装置条技术的应用67]把polyT与polyA特异性配对以及生物素一亲和素色作用相结合，，并首次应用于免疫层析试纸条上。试纸条技术并证明该技术具有较强特异性及较高的测到特定的分子标签，并且在样品添加 2 min 后立肉及肉制品中鸭源成分快速检测的 PCR 可视化性。田卓等[70]指出 PCR-核酸试纸条方法是一种既疫学检测的特异性好的特点，同时操作简便的快速的目的与意义

图 2-1 菌株 FS170522 菌落形态 图 2-2 菌株 FS170522 革兰氏染色结果 1000×图 2-3 菌株 ZS685683 菌落形态 图 2-4 菌株 ZS685683 革兰氏染色结果 1000×2.2.2 分离菌生理生化特性鉴定根据《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[75]和《常见细菌系统鉴定手
【学位授予单位】：佛山科学技术学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S941.4

【参考文献】

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2 余华;何智;严玉宝;杨光友;胡娟;周岷江;;温泉鱼致病性类志贺邻单胞菌和舒氏气单胞菌的分离鉴定和药敏试验[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年

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2 徐海圣;中华绒螯蟹常见病原的分离鉴定、致病及免疫机制研究[D];浙江大学;2004年

本文编号：2696441