鲫鱼TGFβ1基因的克隆及蛋白功能初探

发布时间：2020-06-04 19:09

【摘要】：转化生长因子β1(TGFβ1)是一种多功能的细胞因子,在多种细胞的生长、分化和免疫功能中起着重要作用。本试验采用PCR、生物信息学、实时荧光定量PCR、原核表达、蛋白纯化和液相质谱检测等技术方法对鲫鱼TGFβ1基因结构特征、表达调控以及TGFβ1蛋白在鲫鱼体内的功能进行探究。主要结果如下:获得鲫鱼TGFβ1基因cDNA序列的CDS区序列长1134 bp,共编码377个氨基酸,具有由22个氨基酸构成的信号肽,在胞外表达不属于跨膜蛋白,氨基酸序列上的第280个氨基酸到第376个氨基酸可形成TGFβ样结构域,在鱼类中较为保守,与哺乳动物在进化关系上距离较远。鲫鱼TGFβ1基因对复合益生菌的应答显示:与不添加益生菌的对照组(A)相比,在第30 d时TGFβ1在添加沼泽红假单胞菌组(B)、添加沼泽红假单胞菌+枯草芽孢杆菌组(C)和添加沼泽红假单胞菌+枯草芽孢杆菌+屎肠球菌组(D)心脏、肌肉、肝脏中的表达量极显著上升(P0.01),在第20 d时TGFβ1在B组肌肉中表达上调极显著(P0.01)。TGFβ1下游通路基因TAK-1、SMAD2、SMAD3、SMAD7的检测结果显示:与对照组A相比,在30 d时TAK-1在B组肌肉中表达量极显著降低(P0.01),在20 d时SMAD2、SMAD3、SMAD7在B组肌肉中表达量极显著升高(P0.01)。成功构建表达载体TGFβ1-pDE2,SDS-PAGE电泳显示获得大小约为43 kDa的目的蛋白,纯化后蛋白定量浓度为641.42μg/mL,液相质谱检测表达蛋白为TGFβ1蛋白,肽段评分856,序列覆盖率为50%。表达出的TGFβ1蛋白具有一定的活性与功能。血清学指标结果显示,与注射PBS鲫鱼对照组(S1)相比,在24 h时注射TGFβ1蛋白鲫鱼组(S2)和灌食TGFβ1蛋白鲫鱼组(S3)的碱性磷酸酶和溶菌酶活力极显著上升(P0.01),S2组超氧化物歧化酶活力在36 h时极显著上升(P0.01)。实时荧光定量PCR检测显示,与对照组S1相比,在24 h时S2组和S3组的HSP 30和HSP 47在心脏中表达量极显著升高(P0.01),IL-11在心脏中表达量极显著下降(P0.01)。这表明TGFβ1对鲫鱼免疫机能可能具有一定促进作用。
【图文】：

图 1-1 TGFβ 在肝脏中的作用[63]Fig 1-1 TGFβ roles in liver1.3 TGFβ 信号通路在脊椎动物胚胎发育过程中，TGFβ 信号途径参与其胚胎内中胚层的形成、胚胎体轴图式的形成、胚胎神经发育等[65-67]。TGF/Smad 信号通路作为经典调节的信号通路，已经广泛的被研究。现有研究表明，Smads 以调控蛋白的形式来将TGFβ 与细胞膜表面受体形成的信号介导入细胞内进行调控[68]。TGFβ 除了可以通过 Smad 信号传导途径调节细胞外，一些非 Smad 信号传导途径可以通过其他方式对下游细胞进行调节。比如 TGFβ 可以与 p38 MAPK 以及 JNK 形成非经典信号通路[69, 70]。Zhou J 等[71]在小鼠上的试验发现 TGFβ 诱导激活的 TAK1 可以对 p38 进行更高水平的磷酸化，激活 p38 MAPK 通路来参与肾小管上皮细胞的凋亡与纤维化水平。TGFβ 受体通过调节 TRAF6 来介导 TAK1 的活化进而介导

鲫鱼 TGFβ1 基因的克隆及蛋白功能初探p38 MAPK 和 JNK 的激活。TGFβ/Wnt 信号传导途径对器官形成中的各组细胞着重要的影响[72]。TGFβ/Nodal 信号通路影响着斑马鱼背腹分化过程[67]。研究现骨形态形成蛋白（BMP）信号、Nodal 信号调控斑马鱼胚胎背腹分化都是通TGFβ 信号通路来实现的[73, 74]。此外，TGFβ 信号通路与 PI3K 通路、NF-κB 通等存在着相互协同的关系[70]。
【学位授予单位】：西南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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本文编号：2696844