液相芯片技术和LAMP技术检测致病性弧菌的研究

发布时间：2020-06-05 18:17

【摘要】：弧菌(Vibrio)广泛分布在海洋、江河和湖泊的水体中,从两极的极冷环境到赤道的热带环境的水域中都有分布,随着人们生活水平的提高,对海产品的需求量越来越大,弧菌已然成为了威胁水产养殖和人们的身体健康的重要病原菌,但是弧菌的种类繁多,使在检测和防治方面受到了巨大的挑战,所以建立弧菌的多重检测和基层检测是非常必要的。副溶血弧菌是弧菌中威胁水产养殖的重要病原弧菌,每年都会造成巨大的经济损失,副溶血弧菌有两条染色体,每条染色体上各有一个不同的外膜蛋白ompA的编码基因,分别为VP0764和VPA1186两段基因,取这两段基因分别设计两对引物,F/R引物上分别具有BamH和Sacl酶切位点,用BL21载体进行蛋白表达,纯化鉴定之后用来制备多抗,然后进行免疫磁珠的制备进行菌体捕捉。以副溶血弧菌的毒力因子基因(vptdh)和特异性基因(vptox)、霍乱弧菌的肠毒素基(vcctx)和外膜蛋白基因(vcomp)和溶血素基因(vchly)、拟态弧菌的溶血素基因(vmha)和特异性基因(vmtox)、创伤弧菌的溶血素基因(vvha)和创伤弧菌多重毒素基因(vvrtx)、溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因(vacol)为目的基因设计引物和特异性微球探针,进行液相芯片技术实验研究。设计的引物与五种弧菌以及大肠杆菌、沙门氏菌进行PCR扩增,产物与特异性探针杂交读数,证明得到液相芯片技术具有很好的特异性;特异性探针与不同菌浓度的PCR产物进行杂交,证明得到其具有很高的灵敏度;十种特异性探针分别与单一PCR产物和混合PCR产物进行杂交,证实液相芯片技术多重检测的可操作性。搜索创伤弧菌溶血素A基因(hemolysin gene A,HA)和多重毒素(repeats in toxin,RTX)毒力基因的并设计两种基因的内、外引物,进行LAMP检测目的基因和人工模拟样品,通过肉眼观察白色沉淀,初步判断检测结果,再通过琼脂糖凝胶电泳进一步确认检测结果。LAMP检测两种目的基因灵敏度达到10 CFU/ml,人工模拟样品检测的灵敏度分别为1×102CFU/g(VV-RTX)和1×104CFU/g(VV-HA),与普通PCR比较,具有较高的灵敏度,同时具有用时短,成本低,适合用于基层等优点。
【图文】：

＞逦黎yU？ｈ邋Ｓ邋、、逦＞＿邋＇Ｖ邋＇逦＾逦，逡逑图１－１液相芯片检测原理逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｌｉｑｕｉｄ邋ｃｈｉｐ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ逡逑式反应（ＰＣＲ）技术逡逑应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邋ｃｈａｉｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ，邋ＰＣＲ）技术在方法学上是

液相芯片技术和ＬＡＭＰ技术检n,致病性孤菌的研究逡逑３．１目的基因扩增结果逡逑两个引物以提取的目的基因为目的片段进行扩增，结果如图２－１中Ａ、Ｂ逡逑所示，经过测序后证明，ＶＰ０７６４引物出现了一条与大小约为９０３邋ｂｐ的条带，而逡逑阴性对照组没有条带，ＶＰＡ１１８６引物也出现一条大小约为９３３邋ｂｐ的条带，而阴逡逑性对照组没有出现条带。逡逑ｂｐ邋１逦２逦３逦ｂｐ邋１逦２逦３逡逑：塞姦’邋＇逡逑：：卜邋－逡逑（Ａ）逦（Ｂ）逡逑图２－１基因片段扩增结果逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｇｅｎｅ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔｓ逡逑注：Ａ、＼Ｔ０７６４ＰＣＲ扩增结果；Ｂ、ＶＰＡ１１８６ＰＣＲ扩增结果逡逑１、ＭａｒｋｅｒＤＬ１５０００；邋２、阳性组；３、阴性组逡逑１邋．Ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ１５０００；邋２．Ｔｈｅ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｇｒｏｕｐ；邋３．Ｔｈｅ邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｇｒｏｕｐｓ逡逑３．２质粒构建鉴定逡逑３．２．１菌液ＰＣＲ鉴定逡逑将ＶＰ０７６４和ＶＰＡ１１８６两种外膜的惨败连接转化之后的ＢＬ２１大肠杆菌进行逡逑培养之后，进行菌液ＰＣＲ鉴定，结果如图２－２，邋ＶＰ０７６４的引物扩增的条带大小逡逑和目的基因大小９０３邋ｂｐ相近，ＶＰＡ１１８６的引物扩增的条带大小和目的基因条带逡逑大小９３３邋ｂｐ相近，，阴性对照组都没有条带。逡逑２７逡逑
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S941.4

【参考文献】

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本文编号：2698427