碳酸氢钠对嗜水气单胞菌生长及毒力的影响

发布时间：2020-06-05 23:34

【摘要】：嗜水气单胞菌是淡水鱼类的重要致病菌,在水温较高的季节、集约化高密度养殖情况下常引起养殖鱼类暴发细菌性败血症等疾病,给养殖户带来重大经济损失。目前水产养殖上多采用抗生素防治该类病害,但抗生素的滥用不仅使致病菌产生抗药性,还给环境和人类带来危害。已有研究表明有机碳源能影响嗜水气单胞菌的生长及毒力,但无机碳源对嗜水气单胞菌的影响还未见报道。碳酸氢钠具有抑菌特性,能够抑制大肠杆菌、假单胞菌等细菌生长,但对嗜水气单胞菌是否也有抑制作用尚未可知。因此,本文以嗜水气单胞菌为研究对象,探讨了碳酸氢钠对嗜水气单胞菌生长的抑制效果和抑制机制,以及碳酸氢钠对嗜水气单胞菌致病性和主要毒力基因表达的影响,为合理使用碳酸氢钠抑制嗜水气单胞菌病暴发提供理论依据和数据支持。主要研究结果如下:1.碳酸氢钠对嗜水气单胞菌生长的影响为了探讨碳酸氢钠(NaHCO_3)对嗜水气单胞菌的抑制效果和抑制机理,研究了不同浓度的NaHCO_3及等摩尔浓度(0.2M、0.4M、0.8M)的氯化钠(NaCl)和碳酸氢钾(KHCO_3)对嗜水气单胞菌生长的影响。结果表明随着NaHCO_3浓度的增大,嗜水气单胞菌的生长越来越缓慢。NaHCO_3达到一定浓度后具有杀菌作用,浓度越大,嗜水气单胞菌的死亡率越大,死亡所需时间越短。暴露12h后,0.4M、0.8M NaHCO_3中均无嗜水气单胞菌存活,0.2M NaHCO_3中只有极少数嗜水气单胞菌存活(存活率小于0.01%)。0.2M、04M的NaHCO_3均能有效抑制嗜水气单胞菌生长,而添加等摩尔浓度的NaCl培养液中,细菌生长不受影响;添加等摩尔浓度KHCO_3的培养液中培养的嗜水气单胞菌,其生长情况与添加NaHCO_3的嗜水气单胞菌相似,生长被明显抑制。结果表明NaHCO_3对嗜水气单胞菌的抑制并非由渗透压引起,而是与碳酸氢根有关。研究结果为有效控制嗜水气单胞菌病提供了理论依据。2.不同浓度的碳酸氢钠对嗜水气单胞菌致病性的影响为探讨碳酸氢钠对嗜水气单胞菌致病性的影响,采用不同浓度碳酸氢钠培养的嗜水气单胞菌对斑马鱼进行人工感染,并比较了添加碳酸氢钠、葡萄糖、蔗糖培养的嗜水气单胞菌对斑马鱼人工感染的效果。嗜水气单胞菌的毒力以其对斑马鱼的半致死量大小来衡量,半致死量越高,表明细菌毒力越小。实验结果表明:相比于未添加任何碳源的对照组嗜水气单胞菌,添加了碳酸氢钠培养的嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量明显比对照组高,即浓度范围在0.024M-0.096M的碳酸氢钠能降低嗜水气单胞菌的毒力;而且随着碳酸氢钠浓度的增加,嗜水气单胞菌的毒力逐渐减小;浓度在0.024M-0.096M范围时,添加无机碳源碳酸氢钠培养的嗜水气单胞菌毒性弱于添加葡萄糖、蔗糖等有机碳源培养的嗜水气单胞菌。另外,添加葡萄糖培养的嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量高于添加蔗糖的,说明添加葡萄糖比添加蔗糖更能降低嗜水气单胞菌的毒力。3.碳酸氢钠对嗜水气单胞菌主要毒力基因表达的影响为探讨碳酸氢钠降低嗜水气单胞菌毒力的原因,利用荧光定量PCR技术,以未添加碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为对照组,以添加0.024M、0.048M、0.072M、0.096M、0.12M碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为实验组,对嗜水气单胞菌的三个主要毒力基因---溶血素基因(AHH-1)、气溶素基因(AerA)和弹性蛋白酶基因(ahyB)进行相对表达分析。实验结果表明,添加了碳酸氢钠的嗜水气单胞菌,其AHH-1、AerA和ahyB的表达量均显著低于未添加碳酸氢钠的嗜水气单胞菌。且随着碳酸氢钠浓度的增加,基因表达呈逐渐下调趋势。本实验中,AHH-1、AerA和anyB的表达量均显著降低,且AHH-1、AerA的表达产物均具有溶血活性,弹性蛋白酶能分解弹性蛋白。推测碳酸氢钠主要是通过降低嗜水气单胞菌的溶血活性及分解弹性蛋白的能力,进而降低了其细菌毒性。综上所述,碳酸氢钠对嗜水气单胞菌的生长和毒性具有较好的抑制作用。进一步研究发现,碳酸氢钠可能是通过降低嗜水气单胞菌中溶血物质及弹性蛋白酶相关基因的mRNA表达量,进而降低其毒性。研究结果对防治嗜水气单胞菌病具有一定的指导意义。
【图文】：

生长曲线,嗜水气单胞菌,生长曲线,碳酸氢钠

根据1.2.1的实验方法计算细菌的生长速率常数和代时，绘制不同碳酸氢钠浓度与细菌生长速度指标的关系图（见图2-2）。图2-1 不同浓度NaHCO3下嗜水气单胞菌的生长曲线Fig.2-1 Growth curve of A. hydrophila in different concentration of NaHCO3图2-2 不同浓度碳酸氢钠下细菌的生长速率常数及代时Fig.2-2 Growth rate constant and generation time of A. hydrophila in differentconcentration of NaHCO3嗜水气单胞菌的初始OD600值为0.030。从图2-1可知，碳酸氢钠浓度为0、0.024M、02468101214160 0.024 0.048 0.072 0.096 0.12碳酸氢钠浓度（M）长速率常数生/R时代G（inm）R值 G值

碳酸氢钠,死亡率,嗜水气单胞菌

106.53cfu/mL。图2-3描述了嗜水气单胞菌暴露在不同浓度碳酸氢钠中的死亡率。细菌暴露在0.8M、0.4M碳酸氢钠中达到99.5%死亡率所需要的时间分别是1h和4h，而暴露在0.2M碳酸氢钠中6h，死亡率仅为78.4%。培养12h后，0.4M、0.8M碳酸氢钠中已无细菌存活，0.2M碳酸氢钠中只有极少数细菌存活（存活率小于0.01%）。由此可见，碳酸氢钠浓度越高，嗜水气单胞菌死亡率越大，死亡速度越快。图2-3 不同浓度碳酸氢钠中细菌的死亡率Fig.2-3 Death rate of A. hydrophila after exposure to different concentration of NaHCO3(注：空心的点表示在该时间点没有实际测数，为方便绘图而进行人为计算补充的数值)2.2.3 几种无机盐对嗜水气单胞菌生长影响的比较从表2-1可知
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S941.4

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