杀鱼爱德华氏菌非编码小RNA sR082和sR012的功能研究

发布时间：2020-06-06 00:43

【摘要】：杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)是海水养殖鱼类的重要病原菌,由杀鱼爱德华氏菌引发的爱德华氏菌病给我国水产养殖业造成了巨大的经济损失。细菌非编码小RNA是近些年来发现的一种调控因子,在转录后水平调节基因表达,参与调控环境应答、群体感应(quorum sensing)、生物膜形成、运动性和致病性等生物学过程。目前对于杀鱼爱德华氏菌的感染机制,尤其是非编码小RNA(sRNA)调控的毒力机制仍有待研究。本研究通过对不同生长环境下(正常LB培养,酸性胁迫,缺铁胁迫和氧化胁迫)培养的杀鱼爱德华氏菌提取总RNA进行高通量测序,总共发现有148个sRNA表达,其中19个是已经注释过的sRNA,其它129个未曾报道。相比正常LB培养组,共有103个sRNA在3种胁迫环境下有显著差异表达。根据测序结果,分别选取在酸性条件和氧化条件下具有显著差异表达的sRNA(命名为sR082和sR012)进行深入研究。首先,用qRT-PCR法分析了sR082和sR012在不同生长时期和不同环境胁迫压力下的表达量,结果表明,sR082在细菌生长早期和低pH条件下高表达;sR012在细菌生长对数期高表达。为了研究sR012和sR082生物学功能,利用同源重组法分别构建了sR082和sR012敲除株TXΔsR082和TXΔsR012,比较敲除株和野生株在低pH压力和氧化压力条件下的生长情况。发现TXΔsR082在pH 5条件下生长能力显著降低;TXΔsR012在氧化压力条件下生长能力显著降低。这些结果表明sR082与sR012分别与细菌适应酸性和氧化胁迫能力有关。为分析sR082与sR012对细菌感染宿主的影响,本研究分别比较了TXΔsR082,TXΔsR012与野生株TXD1感染牙鲆细胞、组织和个体能力的差异。结果表明,与TXD1相比,TXΔsR082和TXΔsR012感染牙鲆FG细胞能力、胞内复制能力、组织侵染能力以及致死能力均显著下降。这些结果表明,sR082和sR012在杀鱼爱德华氏菌耐受宿主胞内酸性和氧化环境及感染等方面发挥重要作用。为进一步了解sR012在杀鱼爱德华氏菌中的调控作用,利用TargetRNA2软件对sR012进行靶基因预测,并用qRT-PCR验证靶基因的转录水平。发现共有4个靶基因(ETAE-0114,ETAE-2575,ETAE-3156和ETAE-0911)在TXD1和TXΔsR012中有差异表达,这些结果表明sR012可能通过调控这4个靶基因适应宿主胞内氧化环境从而影响杀鱼爱德华氏菌的毒力。
【图文】：

步骤,肠胃炎,致病过程,严重感染

利用酸中和基因 gadB（谷氨酸脱羧酶）（Srinivasa et al., 2003）、抗氧化基因 KatB（过氧化氢酶）和 SodB（超氧化物歧化酶）（Cheng et al., 2010）来抵抗酸性环境和活性氧杀伤。细菌在巨噬细胞内存活和复制时，III 型分泌系统蛋白 EsaC 和 EseB 表达量显著增加，而鞭毛蛋白和溶血素蛋白 EthA 表达量显著降低，因为细菌在胞内生存时不需要运动和侵染（Wang et al., 2011）。在感染第六步，细菌进一步感染和复制增殖，当细菌的数量增加到一定数量时，从局部感染扩散至全身感染。E. tarda 在感染过程中需要摄取营养物质以保证其在宿主细胞内的复制和增殖。当宿主体内缺乏营养物质如磷酸盐和铁时，细菌可以感知，从而激活高亲和力磷酸盐转运操纵子 pstSCAB-phoU 和铁载体生产基因 astA，增强其在宿主体内的细菌毒力（Srinivasa et al., 2003）。此外，E. tarda分泌的胞外酶（如溶血素，软骨素酶，胶原酶和蛋白酶）（Hirono et al., 1997）和T6SS 蛋白 evpP（Wang et al., 2009d）有助于细菌在全身扩散传播和感染。

维恩图,培养基,爱德华氏菌,环境胁迫

图 2.1 四种不同条件下 sRNA 表达的维恩图德华氏菌 TXD1 在正常 LB 培养基（Con），pH 5 酸性培养基（Ac），100 μM啶培养基（Dp）和 500 μM 过氧化氢培养基（Pe）中培养。图中的数字代表数量。Figure 2.1 Venn diagram of sRNA expression during four diferent conditionsicida TXD1 was culture in normal LB medium (Con), in LB medium with pH= 5.0ress, Ac), in LB medium with 100 μM dipyridyl (iron defciency, Dp), and in LB meith 500 μM hydrogen peroxide (oxidation pressure, Pe). The numbers inside the diaand for the numbers of sRNA.环境胁迫条件下差异表达的杀鱼爱德华氏菌 sRNA
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S941.42

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