Kin17基因在斑马鱼胚胎发育过程中的初步探索

发布时间：2020-06-06 16:31

【摘要】：斑马鱼(Danio rerio)作为近年来发育生物学和遗传生物学的理想模式脊椎生物,具有胚胎体外发育且透明、产卵量大与人类基因组高度相似等优势。Kin17蛋白在各组织中普遍表达且在物种进化中具有严格的保守性。已有研究表明其在生物体内具有DNA复制、损伤及修复,细胞增殖、以及RNA剪接等功能。此外Kin17还有可能是转录因子。Kin17基因作为转录因子在斑马鱼胚胎发育过程中的所起到的作用尚未见报道。本课题选用明星脊椎模式生物--斑马鱼作为研究对象,运用逆转录PCR,荧光实时定量PCR,免疫细胞化学,整体胚胎原位杂交技术以及Morpholino基因抑制等技术对Kin17基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达特性及功能分析进行了初步探究。斑马鱼Kin17基因的生物信息学分析运用生物信息学软件对斑马鱼、人、小鼠、大猩猩等生物的Kin17基因序列进行比对分析,结果显示,通过对斑马鱼Kin17基因序列进行比对发现与人、大猩猩、小鼠等相似度高达75%。利用ProScale、PSIPRED和SWISS-MODEL软件成功的预测出斑马鱼Kin17蛋白的二级和三级结构。分析结果可知斑马鱼Kin17 2CKK.1.A与人类Kin17与人类Kin17蛋白相符,覆盖率达30%。斑马鱼Kin17基因的克隆、时空表达及分析首先,为了检测Kin17基因在各组织中的表达特性,我们通过利用RT-PCR、Q-PCR、免疫组织化学技术对其进行分析。结果表明:Kin17mRNA在原肠期前表达量较低,当胚胎发育到体节期时表达量迅速上升且稳定在较高水平,Kin17基因转录本母源性存在。在斑马鱼的所有组织中均检测到Kin17基因的表达,且高表达于卵巢、精巢、肠道、肌肉组织,特异性的表达于初级精母细胞和次级精母细胞。为了进一步明确Kin17mRNA的特定表达部位,采用整体胚胎原位杂交(WISH)的方法观察斑马鱼胚胎发育不同时期的时空表达图谱。结果显示:Kin17基因在在胚胎卵裂期间就已开始表达,在发育初期呈现普遍性表达,但在卵裂期Kin17mRNA主要分布在生殖质处,在咽囊期在原始生殖细胞(PGC)及视觉神经及脑部垂体处特异性表达。当斑马鱼胚胎受精后24小时即发育到体节早期时可以我们可以明显的观察到有Kin17mRNA大量原始生殖细胞聚集并且分布在脊柱的两侧。在孵化期,Kin17mRNA在原始生殖细胞中仍然稳定存在,特异性地分布在视觉神经及脑部垂体处。通过实验结果分析,斑马鱼Kin17基因作为一个原始生殖细胞特异性表达的基因。运用吗啡啉基因下调技术(Morpholino knockdown)标记的反义核苷酸探针与Kin17mRNA结合,抑制基因表达,观察胚胎发育异常现象。显微注射Kin17吗啉反义寡核苷酸使Kin17基因表达下调,造成斑马鱼胚胎发育延迟,并伴有眼部缺失、腹腔肿大、尾部发育不全等不同程度的发育畸形显现。以上结果显示,Kin17基因的异常表达能调控斑马鱼胚胎的发育。综上结果表明,Kin17基因作为母源性因子在调控斑马鱼胚胎发育中起到了至关重要的作用。Kin17基因在斑马鱼胚胎发育中的具体调控方式和作用机理将是一个值得深入探讨的课题,本课题为探讨斑马鱼胚胎发育机制及影响奠定了重要的理论及实验基础。
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斑马鱼,胚胎发育,文献

4图 1.1 斑马鱼的胚胎发育(摘自文献[18])Fig 1.1 Zebrafish embryogenesis1.2 母源性效应因子在斑马鱼胚胎发育中的作用在脊椎动物的发育过程中,受精卵细胞中存在少量使胚胎正常发育所需的物质称作母源性效应因子[18,19]。所谓合子基因（zygotic gene）是指受母源性基因产物的激活并在胚胎发育过程中显著表达的基因，合子基因表达先后有序共同调控着胚胎发育，合子基因的表达以为这斑马鱼胚胎模式的开启。当胚胎发育进入中囊胚过渡期(midblastula transition,MBT)伴随着部分合子基因开始表达[20]。在受精卵未进入 MBT 期时，，胚胎的发育主要依赖于卵细胞中所产生的以为母源性物质来供给胚胎的正常发育，这些母源性物质主要由未受精时的卵细胞所产生,胚胎的正常发育依赖于这些母源性产物的给养，例如细胞的正常分裂、胚胎的新陈代谢、细胞间的聚集和多个信号通路的调控等都依赖于这些母源性因子[21]。在斑马鱼胚胎发育中,合子基因的表达开始于合子期,当核质比达到一定的比例时细胞

文献,信号,发育模式,硕士学位论文

Wnt信号(摘自文献[35]
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4

【共引文献】