养殖刺参早期发育阶段菌群结构演替及潜在益生菌的筛选

发布时间：2020-06-08 08:24

【摘要】：本文主要研究了养殖刺参(Apostichopus japonicus)早期发育各阶段幼体消化道菌群结构变化,并分析了环境(培育用水、饵料)菌群结构对刺参幼体消化道菌群结构的影响,同时对分离自幼体消化道的菌株进行了益生菌的初步筛选,以期为解析刺参消化道菌群的形成过程和演替规律以及养殖用益生菌的筛选与应用奠定基础。主要研究结果如下:1.采用传统细菌培养方法,对养殖刺参早期发育各阶段幼体体内及环境(投入饵料、培育用水)菌群的组成与结构展开研究,对分离的优势细菌进行分子鉴定,在此基础上进行了刺参幼体体内菌群结构与环境菌群结构相关性分析。细菌培养结果表明,在幼体开口及投喂饵料以后,耳状幼体和樽形幼体体内可分离获得可培养细菌,但数量级较低(10~1 CFU/ind);发育至稚参期以后,消化道可培养细菌总数急剧增加,并在4月龄时期达到10~8 CFU/g数量级。可培养弧菌结果也呈现类似变化趋势,幼体体内可培养细菌中弧菌占比为2.2%~77.3%。对环境菌群的细菌培养结果表明,培育用水中细菌含量变化不显著,随着幼体发育期饵料的转变,不同时期饵料中细菌含量差异显著,幼体体内细菌数量与饵料细菌总数存在显著相关性。自整个养殖系统中共分离到65株优势细菌,根据16S rDNA进行鉴定,结果表明所分离的65株优势菌归属于14个属43种细菌。各菌株在幼体及环境分布统计结果表明Halomonas alkaliantarctica为耳状幼体、樽形幼体共有优势菌;1月龄时期,Vibrio atlanticus、Vibrio natriegens是幼体、饵料、培育用水的共有优势菌,Bacillus tequilensis是幼体、饵料的共有优势菌;2月龄时期,Vibrio alginolyticus是消化道和饵料的共同优势菌;2月至4月龄时期,Vibrio fortis是其消化道的共有优势菌;6月龄时期,Bacillus siamensis是幼体、饵料、培育用水的共有优势菌。相关性分析结果表明在幼体发育初期,其体内菌群与养殖用水的相关性较大,而随着幼体发育,其体内菌群结构与饵料的相关性逐渐增加。2.应用高通量测序技术,对养殖刺参早期发育各阶段幼体体内及环境(投入饵料、培育用水)菌群的组成与结构展开更为深入的研究。自受精卵至樽形幼体时期,变形菌门、拟杆菌门及蓝细菌门的总丰度始终达90%以上;自1月龄至4月龄稚参时期,随着蓝细菌门、浮霉菌门、疣微菌门总丰度的增加,变形菌门的比例大幅降低并在4月龄稚参时期达到最低水平,拟杆菌门的比例则始终处于较低水平(0.91%~3.73%);在6月龄稚参时期,变形菌门又重新占据优势地位(80.32%),而蓝细菌门、浮霉菌门、疣微菌门比例则降至较低水平。在科水平上,假交替单胞菌科是受精卵时期的优势菌科;黄杆菌科在原肠胚期占绝对优势;红杆菌科在原肠胚(G)至樽形幼体(D)时期丰度较高且不断增加(25.11%~34.85%);交替单胞菌科在耳状幼体(A)时期比例相对较高,为14.73%;弧菌科在耳状幼体(A)时期比例相对较高(18.62%),在6月龄(J6)则占绝对优势地位(78.25%);浮霉菌科、疣微菌科为1月龄(J1)至6月龄(J6)的优势菌群,丰度分别为28.27%~40.22%、9.56%~21.37%。对幼体菌群与环境菌群进行相关性分析表明,早期发育幼体菌群与培育用水菌群相似性更高,而到发育后期,幼体菌群受饵料菌群的影响较大。在科水平上,培育用水菌群、饵料菌群对幼体的菌群的影响更为复杂,幼体中的红杆菌科、黄杆菌科细菌丰度主要受培育用水菌群影响,红杆菌科在耳状幼体至4月龄稚参时期(A、D、J1、J2、J4)的丰度变化,与水中该菌科的丰度变化表现出正相关性;黄杆菌科在耳状幼体、樽形幼体时期(A、D)的相对丰度与水中该菌科的相对丰度更为接近。幼体中的弧菌科、浮霉菌科受饵料菌群的影响更为显著,弧菌科在耳状幼体(A)、6月龄稚参(J6)时期中的幼体与饵料中相对丰度,与其他时期相比均处于较高水平,而同时期的培育用水中弧菌科在各时期均处于较低水平;浮霉菌科在樽形幼体至4月龄稚参时期(D、J1、J2、J4)均处于较高水平,同阶段饵料中的该菌科除4月龄时期比水中该菌群的丰度低外,其他时期则比水中的丰度高。3.通过病原拮抗实验、产酶能力测定、安全性评价、生理生化及分子鉴定,对分离自刺参早期发育不同阶段幼体体内的27株菌进行了潜在益生菌的筛选。实验筛选得到对假交替单胞菌和灿烂弧菌具有不同程度抑制作用的2株细菌,来源于1月龄稚参的YB-ZS_5-D对灿烂弧菌和假交替单胞菌均具有较强的抑制作用,来源于6月龄稚参的YB-ZS_(10)-A对假交替单胞菌的抑制作用较强,而对灿烂弧菌的拮抗作用较弱。对两株菌的产酶能力进行了测定,在产淀粉酶能力方面,两株菌的能力相当,水解圈大小达到了22~25 mm;在产酪蛋白酶能力方面,菌株YB-ZS_5-D明显强于菌株YB-ZS_(10)-A。2株潜在益生菌不同浓度(10~7 CFU/mL、10~8 CFU/mL、10~9CFU/mL)的浸浴组的刺参均未出现死亡,活力良好,说明菌株YB-ZS_5-D、YB-ZS_(10)-A对刺参无害。鉴于在拮抗病原菌能力、产酶能力及安全性评价方面,菌株YB-ZS_5-D均优于菌株YB-ZS_(10)-A,因此选择菌株YB-ZS_5-D进行了后续的细菌鉴定及使用效果评价试验,鉴定结果表明菌株YB-ZS_5-D为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)。不同浓度(10~3 CFU/mL、10~4 CFU/mL、10~5 CFU/mL、10~6CFU/mL)的菌株YB-ZS_5-D浸浴实验效果评估结果表明,在养殖水中添加特基拉芽孢杆菌YB-ZS_5-D可显著提高刺参的特定生长率(SGR),并可显著提高肠道胰蛋白酶(TRY)、淀粉酶(AMS)和体腔液ACP、AKP、SOD酶活力,具有良好的刺参养殖用微生态制剂的商业价值,基于效果评价及成本考虑,添加量以10~3 CFU/mL为宜。
【图文】：

主成分分析,刺参,幼体,菌群

图 2-1 不同发育时期刺参幼体体内菌群与环境菌群差异的主成分分析. 2-1 PCA of the samples among the intestine of sea cucumber at different developmental sand its aquaculture system 讨论

菌群,韦恩图,月龄,刺参

图 3-2 各时期刺参幼体菌群与环境菌群 OTUs 比较韦恩图(Z：受精卵；G：原肠胚；A：耳状幼体；D：樽形幼体；J1：1 月龄稚参；J2：2 月龄稚参；J4：4 月龄稚参；J6：6 月龄稚参；W：培育用水；B：饵料)Fig. 3-2 Venne diagram based on the distribution of shared OTUs between the early developmentalsea cucumber at different stages and aquaculture environment
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S968.9

【参考文献】