青岛文昌鱼髓过氧化物酶基因的克

发布时间：2020-06-12 10:13

【摘要】：文昌鱼是国家二级保护动物,在进化上位于脊椎动物与无脊椎动物之间,是研究进化发育的过渡模型。本文对青岛文昌鱼髓过氧化物酶基因进行了克隆,获得了其髓过氧化物酶基因序列,为研究青岛文昌鱼的进化发育、免疫等提供了分子基础。髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)是过氧化物酶家族的重要成员之一,主要存在于嗜中性粒细胞和单核细胞中,是含血红素辅基的血红素蛋白酶,是反应中性粒细胞和巨噬细胞活化的特异性指标。髓过氧化物酶存在于动物体内或其分泌物中,植物中暂时没有发现。目前关于髓过氧化物酶的报道较多集中于人类髓过氧化物酶的研究。髓过氧化物酶氧化反应产生的活性氧和氯胺(NH2Cl)在机体防御中起重要作用;但同时生成的活性氧在产生超过机体清除时就会对正常组织如内皮细胞、脂质、DNA产生损伤,导致多种疾病,如动脉粥样硬化、白血病、肾炎、多发性炎、肿瘤等。本文采用RT-PCR和RACE技术首次克隆了青岛文昌鱼髓过氧化物酶基因的全长cDNA序列是3403bp,5'端非编码区长379bp,3'端非编码区长642bp,开放阅读框全长2379bp,编码793个氨基酸。预测其理论分子质量为87074.09Da,理论等电点为4.78,预测该蛋白属于分泌蛋白,存在信号肽,具有1个跨膜区,且绝大部分蛋白位于膜外。由此可以推测青岛文昌鱼髓过氧化物酶基因编码的蛋白在细胞质中合成,经过跨膜转运,分泌到胞外发挥作用。系统进化分析表明文昌鱼的髓过氧化物酶基因位于脊椎动物大分支和无脊椎动物大分支的中间,并且更偏向于脊椎动物。原位杂交实验与DAB染色实验表明,髓过氧化物酶基因在文昌鱼的表皮、肝盲囊、脊髓中均有表达,在肝盲囊和脊髓周围等表达较高,推测原因是表皮和肝盲囊是构成文昌鱼免疫系统的重要部位,而髓过氧化物酶是免疫反应中重要的酶类之一;至于脊髓高表达的原因有待进一步研究。
【图文】：

Trizol 提取液：Invitrogen 公司，主要无菌去离子水、DEPC 水、氯仿（三2.1.1.2 器具及试剂前期准备塑料制品：（枪头、离心管、研磨棒用 0.1%的 DEPC 水浸泡枪头、离心浸泡过夜，高压，烤干备用，来使 RNas玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，再裹，，150℃烘烤 4 小时（或 180℃烘烤 2 金属制品（包括剪刀、镊子等）：先水。试剂准备：Trizol 试剂、异丙醇、72.1.1.3 实验方法及原理利用 Trizol 法提取青岛文昌鱼的总 检测文昌鱼 RNA 的质量如图 2.1 所

使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增。具体实验方法见附录7。PCR产物各取5μ l进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如下图2.2：M: DL2,000 DNA Marker1：F2/R4 PCR产物(+)2：F2/R4 PCR产物(-)图 2.2 同源基因扩增结果Figure2.2 The result of homologous gene amplified2.2.4 PCR 产物纯化使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver试剂盒切胶回收纯化上述第1泳道长度约1.8kbp、1.6kbp的目的扩增产物条带，依次命名为PCR1、PCR2。
【学位授予单位】：鲁东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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本文编号：2709381