斑节对虾Hsp90及其伴侣因子Cdc37对镉应激相应分子机理研究

发布时间：2020-06-15 23:01

【摘要】：镉属于一种有毒重金属,能够造成斑节对虾(Penaeus monodon)的多种器官及系统的损伤,严重时能够引起虾的死亡。热休克蛋白(Heat shock proteins,Hsps)在细胞中作为一类重要的分子伴侣,在生物体抗应激过程中发挥着重要的作用。Hsp90是热休克蛋白研究较为广泛的一类蛋白,也是在细胞内分布最为广泛的一种蛋白。本实验室之前克隆获得Pm Hsp90的基因全长。为了更好的研究斑节对虾的Pm Hsp90及其分子伴侣Pm Cdc37在镉应激下的分子机制,本次研究首先通过RACE技术克隆表达Pm Cdc37基因,通过原核表达技术获得Pm Hsp90和Pm Cdc37蛋白,并制备Pm Hsp90和Pm Cdc37相关抗体;然后为了检测原核表达蛋白的活性,检测Pm Hsp90的ATPase活性;在成功干扰了Pm Hsp90和Pm Cdc37的基础上,通过注射重组蛋白或者抑制剂统计在金属镉应激下斑节对虾的累计死亡率;最后检测了上述处理样品中血淋SOD的酶活和MDA的含量,实验结果显示Pm Hsp90和Pm Cdc37可以影响斑节对虾体内SOD的活力。为了进一步研究SOD在镉应激下的功能,通过体内注射重组蛋白或者RNA干扰Pm SOD后,检测斑节对虾抗镉应激的能力。镉应激会诱导斑节对虾产生大量活性氧,对蛋白激酶的稳定性和活性造成影响,Hsp90/Cdc37能维持蛋白激酶的活性和功能,增强机体修复能力。目前还没有关于Hsp90/Cdc37对斑节对虾抗镉应激氧化损伤修复机制的研究。本研究拟采用RACE技术、原核表达技术、RNA干扰技术、注射重组蛋白技术对Hsp90/Cdc37保护斑节对虾抗镉应激氧化损伤作用机制进行研究,从m RNA水平、蛋白水平、酶活性水平以及致死率方面揭示Hsp90/Cdc37抗镉应激的作用机理及Cdc37、Hsp90和抗氧化酶相关蛋白的相互作用关系。研究成果丰富了热休克蛋白家族在斑节对虾体内的研究,也可为提高虾类免疫能力提供一定的理论支撑。具体获得的研究成果如下:(1)首先获得了Pm Cdc37得全长,Pm Cdc37 c DNA全长2523bp,包含29 bp的5’-UTR、769 bp 3’-UTR和一个编码351个氨基酸的1053 bp开放阅读框。通过多重序列比对和进化树分析,发现Pm Cdc37在进化关系中保守型不高,各组织分布定量结果显示,Pm Cdc37在斑节对虾各组织中均有分布,而且在肝胰腺和血淋巴中表达量较高。(2)成功构建PET30a-Pm Hsp90和PET21a-Pm Cdc37重组质粒,体外诱导表达Pm Hsp90和Pm Cdc37蛋白并纯化,将纯化的蛋白免疫兔子制备相应的多克隆抗体;为了检测原核表达蛋白的体外活性,通过检测Pm Hsp90的ATPase活性及Pm Hsp90加入Pm Cdc37后的ATPase活性。实验结果表明Pm Cdc37可以降低Pm Hsp90 ATPase的活性,该实验表明原核表达出Pm Hsp90和Pm Cdc37蛋白在体外具有蛋白活性。我们从该实验结果推测出斑节对虾体内Pm Cdc37与Pm Hsp90的结合位点可能与在高等生物中研究的一致,Pm Cdc37是结合Pm Hsp90的N端的ATP结合位点。(3)为了验证Pm Hsp90和Pm Cdc37在镉应激下的表达变化情况,本论文在m RNA水平验证了斑节对虾肝胰腺和血淋巴组织的表达变化,实验结果表示在m RNA水平上Pm Hsp90和Pm Cdc37均有显著性升高,在蛋白水平检测斑节对虾的血淋巴中的蛋白表达水平也有明显的升高。说明Pm Hsp90和Pm Cdc37在斑节对虾中抗镉应激中发挥着作用。在此结论基础上,我们在斑节对虾体内通过注射si RNA和可以干扰Pm Hsp90和Pm Cdc37相结合的天然化学产物雷公滕红素以及注射加有穿刺肽的Pm Hsp90和Pm Cdc37蛋白注射重组蛋白的方法检测斑节对虾在镉应激下的死亡率,实验结果表明,注射重组蛋白的实验组可以减缓斑节对虾的死亡,而抑制或者干扰Pm Hsp90和Pm Cdc37加速斑节对虾的死亡,该试验结果进一步验证了Pm Hsp90和Pm Cdc37可以帮助斑节对虾抵御金属镉的应激。(4)研究表明金属镉能够干扰生物体内氧化应激反应,进而对生物体造成不利。为了探讨Pm Hsp90和Pm Cdc37抵御镉应激是否与氧化还原途径相关。本论文检测在干扰或注射重组蛋白Pm Hsp90和Pm Cdc37后在镉应激下血淋巴中SOD酶活和MDA的含量指标,发现注射重组蛋白Pm Hsp90和Pm Cdc37可以增强SOD酶活力,抑制表达Pm Hsp90和Pm Cdc37后,斑节对虾体内的SOD酶活力减弱。为了进一步研究SOD与镉应激的关系,检测了在镉应激后Pm SOD的m RNA的表达量,发现Pm SOD在肝胰腺和血淋巴中的表达量均是先突然升高随后降低。通过注射重组蛋白和RNA干扰抑制Pm SOD表达,检测在镉应激下斑节对虾的累计死亡率。实验结果证明Pm SOD对斑节对虾在抵御镉应激下也起到一定的防御作用。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：

示意图,单体结构,示意图,周期蛋白

图 1-1 Hsp90 单体结构示意图裂周期蛋白（cell division cycle protein，Cdc）Cdc37 最初是在3]，在非允许的温度下，Cdc37 发生基因突变，使得细胞分种之间进化水平上 Cdc37 基因的氨基酸序列保守性较差，人守性只有 20%的同源性[24]，却是一个功能上相对保守基因，

结构示意图,疏水作用力,分子伴侣

图 1-2 Cdc37 结构示意图7 两者结合表面主要通过疏水作用力相互作用。研90 相结合，需要其他一系列共分子伴侣与其协相结合，再通过与 ATP 结合和水解提供能量，（如图 1-3）：未与 ATP 相结合的 Hsp90 处于开

【参考文献】