三角帆蚌转录组和数字基因表达谱分析及EF-hand基因的表达研究

发布时间：2020-06-15 23:42

【摘要】：我国是淡水珍珠生产大国,产量占全世界淡水珍珠总产量的95%以上,但是大型优质珍珠稀缺,产量较低,很难满足国际及国内珍珠市场的需求。我国淡水资源丰富,多年来生产中以外套膜无核珍珠养殖为主,但由于外套膜较薄,育珠空间受限,不易于培养大型珍珠。而内脏团空间较大,可以植入直径较大的珠核,缩短育珠周期,有利于培养大型珍珠,增加经济效益。但是由于淡水贝类是开放式循环系统,内脏团育珠部位靠近胃、肾、性腺等脏器,所产珍珠不如外套膜所产珍珠光泽好。本课题组长期以来针对如何在内脏团培育出大型优质珍珠而开展了不同层次的研究,对内脏团育珠的生理生化条件、插核部位、免疫反应以及钙代谢相关基因的功能等多方面的探索。三角帆蚌作为我国特有的主要淡水育珠蚌,在珍珠产地广为养殖。由于珍珠的主要成分是Ca CO3,因此加强对三角帆蚌钙代谢相关生物过程以及功能基因的研究具有重要意义。近年来随着生物分子技术的发展成熟,为各物种的功能基因研究提供了实验平台。但是目前软体动物的基因数据信息较为缺乏,海洋贝类的研究相对丰富一些,但是由于水环境的差异较大,淡水贝类的基因与可供参考的海洋贝类也有较大差异,长期以来拖缓了淡水贝类功能基因的研究。随着新一代测序技术的发展推广,转录组结合数字基因表达谱测序技术能够为无参考基因组信息的物种提供高通量数据分析。本研究采取三角帆蚌外套膜前、中、后部、内脏团、性腺、血淋巴6处与育珠相关组织,提取总RNA经检测合格后富集m RNA,经反转录成c DNA加测序接头构建文库,经检测合格后经Illumina Hi Seq2000进行测序。测序得到的原始序列经过滤后得到clean reads,拼接组装成257457条Unigene,经7大数据库比对注释出223345个基因,通过GO功能显著性富集和KEGG Pathway显著性分析筛选出156个与钙代谢相关的同源比对率较高的基因。选取200只体型差异较小的2龄三角帆蚌,随机选取20只为对照组,对其余180只实验组用蚌的外套膜和内脏团各插一粒直径3mm的珠核加一个外套膜小片,在同一水域进行常规养殖。分别各取对照组和插核后第5d、20d、50d、90d的5只蚌,取其外套膜和内脏团育珠部位的组织进行RNA抽提,经检测合格后用于DGE测序。获得10个clean reads 7M以上的DGE文库,与转录组注释序列mapping率都在90%以上,数据质量较高满足后续生物信息分析要求。通过基因差异表达分析、GO功能显著性富集分析和KEGG显著性分析,从转录组筛选出的156与钙代谢相关中筛选到58个表达差异显著的基因,对这58个基因进行不同育珠时期表达变化趋势分析,总结钙代谢相关基因与珍珠形成的表达分析。EF-hand基因是一类与钙代谢功能十分相关的基因,本研究在转录组和DGE分析中找到7个EF-hand基因。首先对这7个基因进行氨基酸多序列比对和进化树分析,找出其相互之间的相似关系。挑选了其中的包含EF-hand钙结合结构域1(EF-hand calcium-binding domain-containing protein 1,EFCB1)基因进行c DNA序列克隆并对其核苷酸序列和氨基酸序列进行生物信息学分析。对EF-hand家族的7个基因进行不同育珠时期的表达分析及对EFCB1基因进行各组织表达分析。结果发现EF-hand基因在外套膜和内脏团组织中表达差异显著,推测这两个组织中珍珠形成基因表达模式差异较大。在不同育珠时间的表达差异有所不同,没有找到统一的表达变化模式。更多功能的发现需要更深层次和多方面的研究,通过对关键基因的表达调控来影响珍珠质的沉积。本研究构建的转录组数据平台以及10个DGE文库为三角帆蚌提供了丰富的基因数据信息,为后续更多功能基因的研究探索以及珍珠形成的分子机理研究奠定了基础,通过更多分子水平的研究和科研力量的投入将最终在三角帆蚌内脏团培育出大型优质珍珠,加快我国珍珠产业的健康持续发展。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【图文】：

原理图,文库构建,原理图,流程

图 1-1 文库构建流程和原理图Fig .1-1 Library building process and principle质量评估HiSeqTM2000 的碱基质量值和测序错误率分别用 Qphred

流程图,信息分析,流程图,海洋大学

信息分析流程图

【参考文献】