吉富罗非鱼HL、LPL基因克隆及饲料胆碱和脂肪水平、投饲频率和投喂水平对其在肝脏中表达的影响
发布时间：2020-06-18 13:24
【摘要】：酯酶(Esterase)是一种水解酶,可在水分子的参与下,经由水解作用,将甘油三酯、磷脂和胆固醇酯等酯类切割成酸类与醇类。此类酶参与多种生物化学反应,依其专属受质、蛋白质结构,以及功能而有不同。催化水解各种酯键的一类酶。通常还包括催化水解羧酸酯和磷酸酯的二类酶。在催化羧酸酯的酯酶中,最常见的如脂肪酶,可催化水解甘油三酯为甘油和脂肪酸。酯酶的催化作用对食物中脂肪的吸收、平衡能量和血浆脂蛋白的代谢起着重要的作用。目前针对酯酶的研究发现,具上述功能的酶包括脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)、肝脂酶(Hepatic lipase, HL)、内皮脂酶(Endothelial lipase, EL)和胰脂酶(Pancreatic lipase,PL)等。本研究以吉富罗非鱼为研究对象,首次采用RT-PCR和RACE法从吉富罗非鱼(farmed tilapia)肝脏克隆得到HL、LPL基因全序列。并通过qRT-PCR技术分析不同脂肪、胆碱以及投饲频率、投喂水平下HL和LPL在肝脏中表达的丰度。主要研究结果如下：1.HL基因全长编码区序列片段的克隆。测序结果显示吉富罗非鱼HL基因包含全长编码区片段大小为1872bp,其中5'非翻译区(5'-UTR)为217bp,3'非翻译区(3-UTR)为176bp,开放阅读框(ORF)为1479bp,编码493个氨基酸,蛋白质分子量为6.3104kD。PolyA加尾信号为AATAAA。2.HL基因生物信息学分析。序列同源性及系统进化分析表明,吉富罗非鱼与罗非鱼、大口黑鲈、鳜鱼、真鲷、斜带石斑鱼、鲢鱼HL基因序列同源性较高,分别为96.6%、84.68%、80.89%、79.48%、76.52%、75.89%;与人、大鼠、小鼠和中华鲟HL基因同源性较低,分别为48.7%、48.99%、49.41%、60.9%。吉富罗非鱼与罗非鱼、大口黑鲈HL氨基酸序列同源性最高,而与人、老鼠、中华鲟HL氨基酸序列同源性最低。这与其亲缘远近关系相符合,表明吉富罗非鱼HL基因在进化中相对保守；使用ExPASy在线软件分析HL基因的氨基酸组成,结构显示,该HL由486个氨基酸组成,最高含量的氨基酸是亮氨酸(10.1%),甘氨酸(7.6%)为第二多含量氨基酸,最低含量的氨基酸是色氨酸(1.9%)。功能分析发现,HL氨基酸理论等电点为8.72,分子量为6.3104kD,负电荷氨基酸残基总数(AsP+Glu)为54个,正电荷氨基酸残基总数(Arg+Lys)为62个,不稳定系数39.65,脂肪系数84.24,总水平疏水性-0.328。应用SignIP程序对HL蛋白N—末端信号肽进行预测,结果显示,吉富罗非鱼HL含有30个氨基酸信号肽。功能结构表明,吉富罗非鱼和其他鱼类HL基因氨基酸序列中均存在脂质结合位点、N-糖基化位点、保守的半胱氨酸位点和催化位点。HL的蛋白质的二级结构分析显示,无规则卷曲蛋白质结构为主,α-螺旋和延伸带散布于整个蛋白中。3.LPL基因全长编码区序列片段的克隆。测序结果显示吉富罗非鱼LPL基因包含全长编码区片段大小为2300bp,其中5'非翻译区(5'-UTR)为126bp,3'非翻译区(3'-UTR)为629bp,开放阅读框(ORF)为1545bp,编码515个氨基酸,蛋白质分子量为5.813596kD。4.LPL基因生物信息学分析。LPL基因的序列同源性及系统进化分析,发现吉富罗非鱼LPL氨基酸序列与哺乳动物同源性为56.12%～56.54%,与鸡同源性为57.35%,与真骨鱼斑马鱼、鳜鱼、大口黑鲈等同源性为67.51%-92.31%,表明LPL在进化中相对保守。其中吉富罗非鱼与鳜鱼LPL氨基酸序列同源性最低,为67.51%,与大口黑鲈同源性最高,达到92.31%。通过相关软件进行氨基酸序列对比,结果显示本研究克隆的吉富罗非鱼肝脏LPL氨基酸与其他物种相比,具有很强的保守性,从中可以证明,本研究克隆得到的正是吉富罗非鱼的LPL基因。应用MEGA3.1软件N-J方法构建系统发育树结果显示真鲷、斜带石斑鱼先聚为一支再和吉富罗非鱼聚为一支,而小鼠和大鼠聚为一支再和原鸡聚为一支,从形态学和生化特征分类来看,本研究得到系统进化树符合相关的规律,进一步说明克隆的为吉富罗非鱼LPL基因。使用相关软件进行LPL氨基酸分析,结果显示,该蛋白质由513个氨基酸组成,其中苏氨酸含量最高为9.0%,其次是亮氨酸7.8%,半胱氨酸含量最低(1.9%)。功能分析发现,LPL氨基酸理论等电点为8.54,分子量为57.8538kDa,负电荷氨基酸残基总数(AsP+Glu)为53个正电荷氨基酸残基总数(Arg+Lys)为58个,不稳定系数30.98,脂肪系数79.81,总水平疏水性-0.323。信号肽研究发现,吉富罗非鱼LPL含有24个氨基酸信号肽的蛋白质。功能结构分析发现,吉富罗非鱼的LPL基因氨基酸序列中与其他鱼类一样都发现存在N-糖基化位点、保守的半胱氨酸位点、脂质结合位点和催化位点。LPL的蛋白质的二级结构分析显示,无规则卷曲蛋白质结构为主,α-螺旋和延伸带散布于整个蛋白中。5.不同胆碱水平、脂肪水平和投喂频率、投喂水平下肝脏中HL活性的表达。应用qRT-PCR的方法检测了吉富罗非鱼肝脏中不同胆碱水平、脂肪水平和投喂频率、投喂水平下肝脏中肝脂酶活性的表达,结果显示胆碱水平分别为750mg/kg和1000mg/kg时,吉富罗非鱼肝脏HL基因表达量随着脂肪水平(4%、8%和12%)的上升而增加,组间差异极显著(P0.01)。当脂肪水平为相同4%时,吉富罗非鱼肝脏HL基因表达量随着胆碱水平(500mg/kg、750mg/kg和1000mg/kg)的上升先下降后上升。而脂肪水平为8%和12%时,肝脏HL基因表达量随着胆碱水平一直处于上升的状态；不同投喂水平和投喂频率对吉富罗非鱼肝脏HLmRNA表达的影响的实验表明,当投喂频率为2次/d时,吉富罗非鱼肝脏HLmRNA表达量随着脂肪水平(2%～10%)的上升先下降后上升,除了脂肪水平为4%的时候,其他脂肪水平的肝脏HL mRNA的表达量均比对照组(2次/d,脂肪水平2%)高。其中脂肪水平10%与2%、8%之间,脂肪水平4%与6%之间均差异显著(P0.05),4%与10%之间差异极显著(P0.01)；投喂频率为3次/d时,各个脂肪水平肝脏HL mRNA表达量总体比对照组(2次/d,脂肪2%)高,且随着脂肪含量的上升,肝脏HL mRNA表达量也呈现上升的趋势。其中脂肪水平为2%与其他组之间,脂肪水平4%与8%、10%之间,脂肪水平6%与10%之间肝脏HL mRNA表达量差异极显著(P0.01),脂肪水平8%与10%之间肝脏HLmRNA表达量差异显著(P0.5),其他组之间差异不显著P0.05)。6.不同胆碱水平、脂肪水平和投喂频率、投喂水平下肝脏中LPL活性的表达。应用qRT-PCR的方法检测了吉富罗非鱼肝脏中不同胆碱水平、脂肪水平和投喂频率、投喂水平下肝脏中肝脂酶活性的表达,结果显示,胆碱水平为500mg/kg时,吉富罗非鱼肝脏LPL基因表达量随着脂肪水平(4%、8%和12%)的上升先下降后上升。胆碱水平为750mg/kg时,吉富罗非鱼肝脏LPL基因表达量随着脂肪水平(4%、8%和12%)的上升而下降,各组之间差异极显著P0.01)。胆碱水平为1000mg/kg时,肝脏LPL基因表达量随着脂肪水平(4%、8%和12%)的上升而呈现上升的趋势,各组之间差异极显著(P0.01)；分析脂肪不变,肝脏中LPL基因表达量的变化情况为,脂肪水平为4%时,肝脏中LPL基因表达量随着胆碱水平的上升而先上升后下降,但脂肪水平为12%时,肝脏中LPL基因表达先下降再上升。脂肪水平为8%时,随着胆碱水平的上升,肝脏中LPL基因表达也一直呈现上升的趋势；投喂频率2次/d情况下,随着饲料中脂肪水平增加,吉富罗非鱼肝脏LPL mRNA表达量先下降再上升继而下降又上升的多变趋势,各组之间差异极显著P0.01)。当投喂频率3次/d,脂肪水平为2%和4%时,吉富罗非鱼肝脏LPL mRNA表达量均低于对照组(2次/d、脂肪水平2%),且随着脂肪水平的上升而下降组间差异不显著P0.05)。但当脂肪水平为6%至10%时,吉富罗非鱼肝脏LPL mRNA表达量随着脂肪水平的上升而呈现上升的趋势,且表达量均远远高于对照组,各组之间差异极显著(P0.01)。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S965.125
【图文】：
Ｗ吉富罗非鱼肝脏ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣ民反应，分别使用简并引物ＨＬ０１Ｆ、逡逑ＨＬ０２Ｒ和ＬＰＬ０１ＦＸＰＬ０２民进行ＰＣ民扩增，分别获得约４１０ｂｐ和１５４５ｂｐ的ＰＣＲ逡逑产物（图３－２），均与目的片段长度相符。切下目的扩增带，胶回收后与ｑＣＲ邋２．１逡逑载体连接，转化感受态Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ，并用上述正反向引物，通过菌液ＰＣ民反应逡逑检测得到阳性克隆。阳性克隆由英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，所得序列逡逑在ＮＣＢＩ网站上ＢＬＡＳＴ确认。逡逑；Ｇ（）ｂｐ逦sD货逡逑４ｉ0ｂｐ逦４００昧逡逑WW逡逑Ａ逦Ｂ逡逑图３－２吉富\ 隆ＨＬ和ＬＰＬ基因证ＮＡ杨巳、片段ＲＴ－ＰＣＲ扩X椊峁义希湾澹曜挤肿恿浚唬粒卞澹坏接妫龋痰拿瘢裕校茫也铮唬拢卞澹宦薹怯悖蹋校痰聂蓿裕校茫义义喜镥义希牛纾澹常插澹粒恚穑欤椋妫椋悖幔簦椋铮铄澹铮驽迦裕罚浚叮蓿澹。房谌缁缅澹龋体澹幔睿溴澹蹋校体澹纾澹睿邋义希汀停铮欤澹悖酰欤幔蝈澹鳎澹椋纾瑁翦澹螅簦幔睿洌幔颍洌螅唬粒欤瘢裕校妹皴澹穑颍铮洌酰悖翦澹铮驽澹龋蹋唬拢保瘢裕校妹皴澹穑颍铮洌酰悖翦澹铮驽澹蹋校体义希ǎ玻╁危怠遥粒茫欧ɡ┰黾宦薹怯慊停蹋校袒颍茫模危粒怠┒隋义隙约宦薹怯愀卧嘧埽遥危两蟹醋挤从Γ渲校悖模危敛镉糜冢校茫依╁义显觯捎茫裕幔耍幔遥徨澹担保疲酰欤戾澹遥粒茫佩澹耄椋羰约梁型萍龇椒ǚ直鸾腥缦虏僮鳎哄义希保状五澹校妹皴澹滓镥澹怠遥粒茫佩澹龋体澹牵樱校卞寮板澹怠遥粒茫佩澹希酰簦澹蝈澹校颍椋恚澹蝈逦
本文编号：2719308
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S965.125
【图文】：
Ｗ吉富罗非鱼肝脏ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣ民反应，分别使用简并引物ＨＬ０１Ｆ、逡逑ＨＬ０２Ｒ和ＬＰＬ０１ＦＸＰＬ０２民进行ＰＣ民扩增，分别获得约４１０ｂｐ和１５４５ｂｐ的ＰＣＲ逡逑产物（图３－２），均与目的片段长度相符。切下目的扩增带，胶回收后与ｑＣＲ邋２．１逡逑载体连接，转化感受态Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ，并用上述正反向引物，通过菌液ＰＣ民反应逡逑检测得到阳性克隆。阳性克隆由英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，所得序列逡逑在ＮＣＢＩ网站上ＢＬＡＳＴ确认。逡逑；Ｇ（）ｂｐ逦sD货逡逑４ｉ0ｂｐ逦４００昧逡逑WW逡逑Ａ逦Ｂ逡逑图３－２吉富\ 隆ＨＬ和ＬＰＬ基因证ＮＡ杨巳、片段ＲＴ－ＰＣＲ扩X椊峁义希湾澹曜挤肿恿浚唬粒卞澹坏接妫龋痰拿瘢裕校茫也铮唬拢卞澹宦薹怯悖蹋校痰聂蓿裕校茫义义喜镥义希牛纾澹常插澹粒恚穑欤椋妫椋悖幔簦椋铮铄澹铮驽迦裕罚浚叮蓿澹。房谌缁缅澹龋体澹幔睿溴澹蹋校体澹纾澹睿邋义希汀停铮欤澹悖酰欤幔蝈澹鳎澹椋纾瑁翦澹螅簦幔睿洌幔颍洌螅唬粒欤瘢裕校妹皴澹穑颍铮洌酰悖翦澹铮驽澹龋蹋唬拢保瘢裕校妹皴澹穑颍铮洌酰悖翦澹铮驽澹蹋校体义希ǎ玻╁危怠遥粒茫欧ɡ┰黾宦薹怯慊停蹋校袒颍茫模危粒怠┒隋义隙约宦薹怯愀卧嘧埽遥危两蟹醋挤从Γ渲校悖模危敛镉糜冢校茫依╁义显觯捎茫裕幔耍幔遥徨澹担保疲酰欤戾澹遥粒茫佩澹耄椋羰约梁型萍龇椒ǚ直鸾腥缦虏僮鳎哄义希保状五澹校妹皴澹滓镥澹怠遥粒茫佩澹龋体澹牵樱校卞寮板澹怠遥粒茫佩澹希酰簦澹蝈澹校颍椋恚澹蝈逦
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