牡蛎疱疹病毒流行病学调查及毛蚶分离株生物学特性初步分析

发布时间：2020-06-18 17:33

【摘要】：牡蛎疱疹病毒1型(OSHV-1)属软体动物疱疹病毒科(Malacoherpesviridae)、牡蛎疱疹病毒属(Ostreavirus),是一种双链DNA病毒,在世界范围内广泛流行,一直以来都是制约我国贝类养殖业健康发展的主要传染性病原之一。近几年,牡蛎疱疹病毒病频频爆发,导致贝类生长受阻和高死亡率,给我国贝类养殖业造成了巨大的经济损失。目前人们常用的牡蛎疱疹病毒检测方法就是设计引物进行PCR扩增,但是最近几年不同变异株的出现,以前的检测方法存在一定的局限性,本试验对比NCBI不同变异株的序列,选取C区保守区域,使用巢式PCR检测方法。设置7个依次十倍递减的不同的浓度梯度的病毒DNA,检测其灵敏性,此方法灵敏度比普通PCR高,特异性良好。用巢式PCR检测方法对山东七个沿海地区主要养殖经济贝类(毛蚶、魁蚶、扇贝、牡蛎、菲律宾蛤仔、文蛤、贻贝等)及野生经济贝类(扁玉螺、四角蛤、蛏子等)进行检测,根据检测结果总结出2017-2018年间山东省主要经济贝类的牡蛎疱疹病毒1型病爆发的流行病学规律,建立OsHV-1的预警机制。2017年在山东不同地区共采集了340份样品,其中阳性样品39份,阳性总检出率11.5%,阳性检出存在地域性,东营地区检出率最高,为33.3%;不同种类中,四角蛤的阳性检出率最高,约为44%。2018年在山东沿海不同地区共采集了503份样品,其中阳性样品79份,阳性总检出率为15.7%;青岛样本的阳性检出率最高,达到68%。共检测了十个不同品种,不同品种的阳性检出率结果显示,扁玉螺阳性检出率最高,为40%,脉红螺的阳性检出率为33.3%,毛蚶的阳性检出率为26.3%,菲律宾蛤仔的阳性检出率为23%,扇贝的阳性检出率为11%,贻贝的阳性检出率为6.7%,四角蛤的阳性检出率为6.3%,牡蛎的阳性检出率为5%,斑纹蛤和蛏子中未发现阳性样本。牡蛎疱疹病毒不仅感染双壳贝类,对一些腹足纲贝类也有很大的感染性,宿主范围存在扩大的现象;对水质进行了pH、氨氮、亚硝酸盐的检测,养殖水体的环境基本正常。对羊口采集的病料进行变异区C区(ORF4/5)的测序分析,对比NCBI数据库与不同变异株进行比对,绘制进化树,得出羊口死亡毛蚶分离株与中国发现的魁蚶株亲缘关系最近,通过动物感染试验,临床症状表现为:闭壳肌无力,行动迟缓,对外界刺激反应缓慢,摄食量少或者基本不进食,经PCR检测及测序后确诊为牡蛎疱疹病毒,确定了毛蚶是一种新的宿主,通过感染试验证明了该分离株存在水平传播,且在感染试验第6天,毛蚶幼贝开始出现死亡,第12天毛蚶幼贝全部死亡;羊口分离株不仅对于毛蚶存在感染性,对菲律宾蛤仔和扇贝也存在感染性,证明了该种病毒的不同物种的致病性。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S944.121
【图文】：

电泳图,电泳图,引物,幼贝

调节为 20℃，1、2、3 号缸注射羊口分离株病毒试验组注射前先用 MgCl2（20g/L,W/V）进行麻醉完在避光阴凉处放置两个小时，再放入培养缸中喂，观测毛蚶的死亡率，并检测。粒毛蚶幼贝，水温 20℃，提前充氧，放入一只攻粒扇贝幼贝，水温 20℃，提前充氧，放入一只攻粒菲律宾蛤仔幼贝，水温 20℃，提前充氧，放入个平行试验，观测结果。测方法结果

特异性检测

图 2 特异性检测图Fig. 2 specific detection mapM:DNAMarker, 泳道 1：患病组织 DNA, 泳道 2：牡蛎疱疹病毒泳道 3：副溶血弧菌泳道，4：派琴虫，泳道 5：阴性对照。增，只有患病组织 DNA 和 OsHV-1 有目的条带以证明该巢式 PCR 检测方法有良好的特异性。

【参考文献】