皱纹盘鲍不同选育群体对弧菌刺激的差异响应及其机制研究

发布时间：2020-06-21 10:55

【摘要】：皱纹盘鲍是我国重要的海水养殖贝类,也是人们喜爱的海产品之一,通过增养殖工作者的努力以及各种新式养殖模式的普及,中国已成为世界上首屈一指的养鲍大国,虽然我国鲍养殖品种较少,主要为皱纹盘鲍和南方沿海少数的杂色鲍,但是仅凭皱纹盘鲍一种的产量已经超过世界上其他国家各种鲍养殖产量的总和。现在鲍养殖产量的逐年提高离不开优质鲍品种的推广、充足饵料的投喂、良好的养殖水质、精心的养殖管理以及重要的疾病防控手段。皱纹盘鲍是软体动物门中普通的一员,与其他海洋无脊椎动物一样,没有进化出以抗体为主的特异性免疫系统,仅拥有非特异性免疫系统或者说先天免疫系统。鲍的先天免疫在复杂多变的海洋环境中起到重要作用,在与环境相互选择进化的过程中,不断完善的先天免疫系统使这种古老的物种在地球上生活了上亿年。有历史记载人类在7万5千年前已经开始利用及食用鲍。在我国,鲍自古以来就被当作海产珍品,涉及到鲍的美食有很多,且鲍全身是宝,鲍壳也是名贵中药,在我国鲍的大规模养殖与此也颇有关系。世界上鲍品种虽多,但是各种鲍在养殖过程中都有疾病爆发的情况,特别在大规模集约化的养殖条件下,伴随环境污染、海洋酸化及全球变暖的加剧,鲍养殖的海洋环境也日渐恶化,疾病频发,这其中弧菌导致的疾病占绝大多数。弧菌疾病是海洋生物的常见致病菌,对海洋生物及人类危害严重。本研究从观察到皱纹盘鲍不同选育群体在受到弧菌侵染后有不同的死亡率后,进行了如下研究:皱纹盘鲍不同品系对弧菌耐受性差异的检测;皱纹盘鲍抗弧菌品系的筛选及筛选效果的检测;抗弧菌筛选后的群体与一般群体对弧菌刺激时的差异响应。现将本阶段实验结果总结如下:1皱纹盘鲍不同品系对弧菌耐受差异的检测皱纹盘鲍97-G6、98-G6群体均用三种弧菌(溶藻弧菌、哈维氏弧菌和鳗弧菌)进行攻毒实验,实验周期为7天,在不同的弧菌浓度下,皱纹盘鲍两选育群体都随注射弧菌菌液的浓度升高而死亡率增加。并且可以发现皱纹盘鲍97-G6和98-G6群体对溶藻弧菌(bb3)的耐受性类似,而皱纹盘鲍98-G6群体对哈维氏弧菌(bb4)和鳗弧菌(vm)的耐受性高于97-G6群体。2皱纹盘鲍抗弧菌品系的筛选及筛选效果的检测利用检测皱纹盘鲍不同选育群体敏感性存活下的个体,混合一起命名为R1群体;再用较高浓度三种弧菌混合菌液注射4059只健康未经筛选过的皱纹盘鲍97-G6群体,其中bb3、bb4、vm三种弧菌的终浓度为5×106,1×105,5×106cfu/mL待死亡率稳定时统计,发现总共存活鲍321只,累积死亡率达到92.09%,符合一般的筛选强度,将存活下的皱纹盘鲍群体定义为R2群体,对应的所有未经过筛选的对照群体定义为CK群体。皱纹盘鲍R1群体和CK群体在同时注射三种弧菌混合菌液挑战后,R1群体死亡率为36.67±4.49%,CK群体死亡率为84.00±6.37%,两者死亡率差异极显著(P0.01);对六个月后筛选的群体R2及未筛选过的群体CK同时注射单一弧菌 bb3、bb4 及 vm,浓度分别为1 ×106cfu/mL、1×106cfu/mL、3×107cfu/mL 发现待两组死亡率稳定后,其中注射bb3后R2群体死亡率为13.33±4.71%,CK群体为53.33±9.43%,两者死亡率差异极显著(P0.01),注射bb4后,R2群体死亡率为23.33±4.71%,CK群体为83.33±12.47%,两者死亡率差异极显著(P0.01),注射vm后,R2群体死亡率为0%,CK群体为36.67±4.71%,两者死亡率差异极显著(P0.01),利用弧菌的混合再次注射及单独再次注射同时说明了抗弧菌筛选的效果明显。3抗性群体R2与对照群体CK对弧菌刺激时的差异响应本研究挑选了 5个与皱纹盘鲍免疫防御相关的基因,包括皱纹盘鲍防御素基因(Defensin)、溶菌酶基因(Lysozyme)、热激蛋白70基因(HSP70),一个与细胞凋亡相关基因一氧化氮合成酶基因(NOS)和一个与功能多样的,且研究逐渐深入的血蓝蛋白基因(Hemocyanin);通过RT-PCR方法比较哈维式弧菌注射后,这些基因的表达量变化,来反映皱纹盘鲍两群体受到弧菌刺激时的差异响应。结果表明R2群体的防御素基因、溶菌酶基因、一氧化氮合酶基因的相对表达量均显著低于对照群体;但R2群体外套膜和肝胰腺中组织的血蓝蛋白基因相对表达量高于对照样本;R2群体的HSP70基因在外套膜中的表达量显著低于对照,但在肝胰腺和鳃组织中的表达量则显著高于对照。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S944.45
【图文】：

血蓝蛋白,吸收峰

有铁辅因子的存在，而血蓝蛋白呈现蓝色是因为一价铜离子结合氧变为二价铜离逡逑子而成为蓝色。血蓝蛋白在２８０邋ｎｍ有吸收峰，但氧合后的血蓝蛋白在３４０邋ｎｍ处逡逑有明显的吸收峰（图１．２）。逡逑０．５邋逦逡逑Ｂ邋？？？？逦ａ逦ｂ逡逑ｉ：Ａ逦Ｉ逡逑Ｉ逦？逡逑？邋？邋？邋？邋Ｄｅｏｘｙ－Ｈｃ逡逑0？！逦＂邋■■邋Ｏｘｙ￣Ｈｃ逡逑０邋逦逦山邋ＡＸ…一…逡逑２６０逦２８０逦３００逦３２０逦３４０逦３６０逦３８０逦４００逡逑Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ邋（ｎｍ）逡逑图１．２血蓝蛋白吸收峰（Ｃｏａｔｅｓ邋ｅｔａｌ．，２０１２）逡逑Ｆｉｇ．１．２邋Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ邋ｓｐｅｃｔｒａ邋ｏｆ邋ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ逡逑在９０年代之前血蓝蛋白被认为只有运输氧气的功能，但是从Ｄｅｃｋｅｒ邋ａｎｄ逡逑Ｒｉｍｋｅ发现一种蜘蛛的血蓝蛋白具有酚氧化酶的活性之后，关于血蓝蛋白功能的逡逑研究又进入了一个新的时代。酚氧化酶是广泛的存在于各种生命体中的一种防御逡逑外源物质入侵的一种酶，而且在发育过程中酚氧化酶也起作用。血蓝蛋白及酚氧逡逑化酶都属于３型铜蛋白家族成员，两者在结构上有高度的相似性。据研宄推测血逡逑蓝蛋白转变成酚氧化酶样物质主要通过两种方式，一种可能是蛋白质的裂解，另逡逑一种是血蓝蛋白受到物理破坏，使其构象发生改变，在体外实验中，研宄人员利逡逑用ＳＤＳ使血蓝蛋白解折叠

幼鲍,皱纹盘鲍,死亡率

图２．１注射ｂｂ３对皱纹盘鲍９７－Ｇ６和９８－Ｇ６幼鲍死亡率的影响逡逑Ｆｉｇ．２．１邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｎ邋ｍｏｒｔａｌｉｔｙ邋ｏｆ邋ｂｂ３邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ邋ｔｏ邋９７－Ｇ６邋ａｎｄ邋９８－Ｇ６邋ｊｕｖｅｎｉｌｅ邋ａｂａｌｏｎｅ逡逑在低等剂量（５Ｘ］０５ｄＵ／ｍＬ）邋ｂｂ３注射处理组，９７－Ｇ６和９８－Ｇ６幼鲍在７ｄ内逡逑的平均累积死亡率分别为４４．４４±４．１６％与６０±９．８１％，９８－Ｇ６幼鲍的死亡率高于逡逑

【参考文献】