草鱼出血病病毒VP7蛋白重组乳杆菌疫苗的制备及初步应用

发布时间：2020-06-21 11:39

【摘要】：草鱼出血病是一种由草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhage virus,GCRV)引起的传播能力强、致死率高严重危害草鱼业发展的重要疾病。目前几乎没有治疗草鱼出血病的药物,且长期用药易导致水体污染、产生抗药性等问题。疫苗免疫是一种预防草鱼出血病较为可行的方案,但由于注射免疫操作繁琐、易对鱼体造成伤害、产生应激,浸泡免疫效果差且易造成环境污染。因此,急需研发适于操作且免疫效果佳的解决方案。乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一种公认的食品级安全的微生物,以其为载体研制口服疫苗是乳酸菌应用的新领域和新热点。本研究通过克隆GCRV外壳蛋白VP7并将其连接、转化至植物乳杆菌NC8中,制备乳杆菌介导的草鱼出血病口服疫苗,进而通过口服饲喂草鱼进行免疫效果评价:试验设置5个分组,1.0×10~9 CFU/g口服免疫(pSIP409-vp7)组、1.0×10~8CFU/g口服免疫(pSIP409-vp7)组、1.0×10~9 CFU/g空载体(pSIP409)组、1.0×10~8CFU/g空载体(pSIP409)组和空白对照(PBS)组,饲料投喂量按照体重的3%进行投喂,每天投喂1次,连续投喂2天。两周后按照同样的方式加强免疫一次。免疫结束后的第1 d、3 d、7 d、12 d、16 d、21 d、31 d和38 d分别采集血液、肝、肾,利用ELISA法检测血清中IgM抗体动态水平;利用RT-PCR法测定口服免疫重组乳酸菌疫苗对草鱼免疫相关基因IL-1β、IFN I、MHC-II B表达的影响;利用检测试剂盒测定血清中溶菌酶及肝脏中POD、SOD的活性;取肠道组织,研究重组乳酸菌在草鱼肠道内的定植情况,取得结果如下:ELISA结果显示:口服免疫(pSIP409-vp7)组血清中IgM的抗体水平均呈现先增加后平稳的趋势且均显著高于空载体(pSIP409)组和空白对照(PBS)组(P0.05),并于第12d时达到峰值(OD_(490):1.29;OD_(490):1.19)。同时,1.0×10~9 CFU/g口服免疫(pSIP409-vp7)组的抗体水平高于1.0×10~8 CFU/g口服免疫(pSIP409-vp7)组。RT-PCR结果显示:口服免疫乳酸菌疫苗后,两个浓度组肾脏的免疫相关基因IL-1β、IFN I、MHC-II B表达量均呈现升高趋势,其中口服免疫(pSIP409-vp7)组表达量显著高于空载体(pSIP409)组和空白对照(PBS)组,且1.0×10~9 CFU/g口服免疫(pSIP409-vp7)组的表达量明显高于其它组别(P0.05)。非特异性免疫指标检测结果显示:口服乳酸菌重组疫苗可显著提高草鱼血液和肝脏中超氧化物歧化酶(SOD),过氧化物酶(POD)和溶菌酶(LZM)的活性,且其活性均显著高于空白对照(PBS)组(P0.05)。两个浓度组的口服免疫(pSIP409-vp7)组SOD、POD和LZM活性在7-12 d达到峰值。肠道定植试验结果表明,重组乳酸菌主要定植在草鱼肠道后端,其定植时间为7-12d。上述结果表明重组乳酸菌疫苗可显著提高草鱼IgM的抗体水平以及非特异性免疫指标水平,并可促进免疫相关基因的表达水平,进而提升草鱼的免疫反应水平,结果可为其他水产动物相关病毒的防治提供新的思路。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S943
【图文】：

图 1.2 pSIP409- vp7 重组质粒提取结0 DNAMarker； 1、2、3： pSIP409.2 pSIP409-vp7 recombinant plasmid exNAMarker; 1, 2, 3: pSIP409-vp7 plasm409-vp7 的 PCR 扩增与酶切鉴定9-vp7 为模板，进行 PCR 验证和片段大小和双酶切条带大小与预p 大小的目的条带；双酶切检测1 bp 大小的条带。将 PCR 扩增产段序列完全一致。经上述结果可判 1.3、1.4。

PCR鉴定M：DL10000DNAMarker；1：PCR产物

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本文编号：2724012