赤眼鳟和草鱼TLR22的结构差异及应对GCRV感染的表达特性

发布时间：2020-06-22 07:30

【摘要】：草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)感染引起的传染性草鱼出血病,严重制约了草鱼养殖产业的健康有序发展。赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)和草鱼(Ctenopharymgodon idellus)同属于鲤科,雅罗鱼亚科。基于课题组团队的前期研究结果赤眼鳟和草鱼对GCRV的不同表型性状,为探讨TLRs(Toll like receptors)通路中相关基因的表达特性,本研究克隆赤眼鳟TLRs通路中相关基因,分析其应对GCRV的表达特性;并结合分子生物学、细胞生物学和生物信息学方法对比分析赤眼鳟TLR22(ScTLR22)和草鱼TLR22(CiTLR22)在识别和应对GCRV感染的功能差异,以期从TLRs受体层面对赤眼鳟和草鱼表现出不同的GCRV抗性表型提供一定的理论依据。主要研究结果如下:1赤眼鳟TLRs通路抗病毒相关基因克隆与表达特性分析对赤眼鳟TLRs通路中抗病毒相关基因TLR22,MyD88(Myeloid differentiation primary response protein 88)和IRF3(IFN regulatory factor 3)基因进行了cDNA克隆和应对GCRV的表达特性分析。结果显示:赤眼鳟TLR22,MyD88和IRF3均参与了机体的抗GCRV病毒免疫反应,且体外过表达赤眼鳟TLR22和IRF3能抑制GCRV在CIK细胞中的复制。2赤眼鳟和草鱼TLR22基因的结构特征分析对赤眼鳟和草鱼TLR22结构特性比较分析结果显示,ScTLR22最后一个LRR(LRR18)在LRR-CT(C-terminal LRR domain)上游12个氨基酸处,和斑马鱼、鲤鱼相似,而CiTLR22的最后一个LRR(LRR17)在LRR-CT上游60个氨基酸处;ScTLR22的TIR结构域中3个保守区域氨基酸序列和斑马鱼、鲤鱼等完全一致,而和草鱼相比,Box1和Box2中均有一个氨基酸突变。为探讨赤眼鳟和草鱼TLR22识别区域的结构差异是否导致不同的识别能力,对赤眼鳟和草鱼TLR22的识别区域和dsRNA类似物poly(I:C)的分子对接结果显示:ScTLR22和poly(I:C)形成的复合物在绑定能、分子间能量、氢键数量和键长等方面均优于CiTLR22。因此推断,ScTLR22胞外识别区域结合poly(I:C)的能力比CiTLR22强。3赤眼鳟和草鱼TLR22识别GCRV诱导抗病毒因子表达能力比较为验证赤眼鳟和草鱼TLR22识别区域结构差异和功能的关系,分别在CIK(Ctenopharyngodon idella kidney)细胞中过表达ScTLR22、CiTLR22和融合表达ScTLR22的识别区域和CiTLR22跨膜结构域和TIR信号传导结构域(ScE/CiC),并检测GCRV感染相关抗病毒因子的表达水平变化。结果显示,GCRV感染后,IRF3、IFN-β和IL-1β的表达水平在过表达ScTLR22、CiTLR22和ScE/CiC的CIK细胞中显著上调表达;且过表达ScE/CiC的CIK细胞中IFN-β和IL-1β表达水平显著高于过表达ScTLR22和CiTLR22的CIK(P0.05)。同时,过表达ScE/CiC的CIK细胞对GCRV敏感性显著低于过表达CiTLR22的CIK(P0.05)。因此,ScTLR22的胞外识别区域识别GCRV后诱导IFN-β和IL-1β表达,抵抗GCRV入侵的能力优于CiTLR22。综上所述,赤眼鳟TLR22、MyD88和IRF3均参与了机体的抗GCRV病毒免疫反应,同时赤眼鳟和草鱼TLR22胞外识别区域的结构差异,导致它们对GCRV的识别能力的不同,影响IFN-β和IL-1β等抗病毒因子的表达,导致不同的抗性表型。本研究结果有助于从TLRs受体层面解释草鱼和赤眼鳟对GCRV的不同表型性状。
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4
【图文】：

模式图,典型结构,模式图,结构域

原微生物。1996 年，Lemaitre 等最先从果蝇上发现 Toll 样受体，从而验证了eway 的 PRR 理论[6]。TLR4 是从人体上分离的第一个 TLRs，因其定位于第 4 号染，因此命名为 TLR4。TLRs 属于 I 型跨膜蛋白，包括三个部分：N 末端特异性识PAMPs 的富亮氨酸重复结构域（Leucine-rich repeat, LRR），跨膜结构域ansmembrane domain, TM)和 C 末端下游信号转导的 TIR 结构域（Toll/IL-1 receptain, TIR）[7]（图 1-1B ）。N 端 LRR 识别结构域呈马蹄状，包括 15~20 个 LRR，每LRR 含有 24~29 个氨基酸，N 端 LRRs 具有“LxxLxxLxLxxNxLxxLxxxxFxx”保守区图 1-1A），其中 L 为亮氨酸或异亮氨酸（I），缬氨酸（V），蛋氨酸（M）和苯丙氨F）。N 表示天冬氨酸（D），或半胱氨酸（C），丝氨酸（S）和苏氨酸（T）；F 表示氨酸。C 端的 LRR 的长度和氨基酸序列保守性低[8]（图 1-1C）。C 端的 TIR 结构 TLRs 识别 PAMPs 后信号传导的核心元件，其氨基酸序列在物种间保守性较高，三个非常保守的功能区域 box1（FDAFISY）、box2（GYKLC-RD-PG）和 box3（多基酸环绕的色氨酸），且研究证明 box1 和 box2 在 TLRs 和具有 TIR 结构域的蛋白作用中发挥重要作用，而 box3 则通过与细胞骨架相互作用，参与受体的定位[9-10]。

环形系统,鱼类,模型构建,泊松分布

图 1-2 鱼类 TLRs 环形系统发育树Fig. 1-2 Circular phylogenetic tree of all known full-length fish TLR amino acid sequences：环形系统发育树使用 MEGA7.0.21 邻接法（Neighbor Joining）泊松分布模型构建ote: MEGA 7.0.21 reconstructed a phylogenetic tree according to the Neighbor Joining method using oisson correction distance model. Only bootstrap values above 70% are indicated.系统发育树构建所使用的 TLRs 氨基酸序列 GenBank 登录号如下：CarassiusgibeTLR2 AGR53440.1); Catla catla (TLR22 AGW43269.2); Ctenopharyngodon idella (TLRGM21642.1; TLR9 DB96920.1; TLR3 ABI64155.1; TLR22 ADX97523.2; TLRHN49762.1;TLR5a AIO11757.1; TLR18 AIB55030.1; TLR5b AIO11758.1); Chiloscylliriseum (TLR3 AHG94983.1); Chionodraco hamatus (TLR9 ACT64129.1; TLCT64127.1); Clarias batrachus (TLR21 AGM39445.1); Cynoglossus semilaevis (TLCL68661.1); Danio rerio (TLR22 NP_001122147.2; TLR6 NP_001124065.1; TLAQ90474.1; TLR4b AAQ90475.1; TLR1 AAI63271.1); Epinephelus coioides (TLEB32453.1; TLR1 AEB32452.1; TLR22 AGA84053.1); Gadus morhua (TLR

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