靶向性碳纳米管载疫苗系统防治鲤春病毒血症研究

发布时间：2020-06-23 06:17

【摘要】：鲤春病毒血症(Spring viremia of carp,SVC)是危害鲤科鱼类的一种急性、高传染性和高致死性的水产疾病,对水产养殖业造成了巨大的经济损失。同时,SVC也是必须要向世界动物卫生组织申报的动物疫病之一。疫苗免疫是对其进行防控的最有效措施。在水产动物免疫途径中,注射方式效果最好,但不适合渔业生产;浸浴免疫操作简单,适合在鱼苗和鱼类大规模养殖中推广使用。但是浸泡疫苗的应用需要克服生物屏障等阻碍作用,才能使疫苗发挥出理想的免疫效果。纳米载疫苗靶向递呈技术的研究是解决水产养殖产业实现疫苗高效免疫保护最安全有效的手段之一。本研究通过化学修饰技术构建靶向性碳纳米管载疫苗系统,经浸浴和注射的方式免疫鲤后评价该疫苗系统对SVC的预防效果,并进一步通过免疫荧光和活体成像技术研究该疫苗系统的免疫增效机制,最后从免疫浓度、免疫密度和浸浴免疫时间这几方面进行免疫方案优化。取得的结果如下:1.靶向性碳纳米管载疫苗系统的构建采用发酵和纯化技术制备重组SVCV糖蛋白(G),并经过化学修饰技术分别对单壁碳纳米管(SWCNTs)和甘露糖(Mannose)进行结构修饰,再通过化学连接技术,构建靶向性碳纳米管载疫苗系统(SWCNTs-MG)。随后,将疫苗系统与鲤巨噬细胞、鲤上皮细胞(EPC)和鲤进行共孵育,通过细胞活力检测和组织切片观察等方法进行疫苗系统的安全性评价。结果显示:靶向性碳纳米管载疫苗系统已构建成功,其中抗原蛋白约占40.2%,甘露糖约占3.4%。在细胞水平,浓度小于40μg/mL的疫苗系统处理后,鲤巨噬细胞和EPC细胞的存活率均达到了80%以上;在个体水平,疫苗系统对鲤以60 mg/L的浓度进行浸浴免疫24 h后,鲤的脑、鳃、肠、肾、肝和脾等组织器官均未出现损伤或异常,并且在免疫后60 d内,和对照组相比,免疫后的鲤没有出现病变或异常。2.靶向性碳纳米管载疫苗系统的免疫效果研究将靶向性碳纳米管载疫苗系统分别通过浸浴和注射的方式免疫鲤(1.0±0.2 g),采用酶联免疫吸附法、荧光定量PCR和病毒攻毒来评价该疫苗系统的免疫效果。结果显示:无论是通过浸浴免疫还是注射免疫,和对照及其他同浓度/剂量的疫苗(G、MG和SWCNTs-G)相比,SWCNTs-MG可显著提高免疫后鲤的血清抗体效价水平(P㩳0.01);增强补体C3、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性(P㩳0.05)和免疫相关基因(TNF-α、IL-10、Cxcr 1、Cxca、IFNg2b、IgM和IgZ 1)的表达水平(P㩳0.05);SVCV对免疫后的鲤攻毒后,纯G亚单位疫苗浸浴和注射免疫最高浓度(30 mg/L)或最高剂量组(12μg/尾)的免疫保护率分别仅为19.2%和34.6%,而SWCNTs-MG疫苗浸浴和注射免疫最高浓度或者剂量组的免疫保护率分别为63.5%和73.1%。3.免疫增效机制研究采用荧光标记技术,用异硫氰酸荧光素(FITC)分别对4种疫苗:G(糖蛋白)、MG(甘露糖化糖蛋白)、SWCNTs-G(碳纳米管载糖蛋白)和SWCNTs-MG(碳纳米管载甘露糖化糖蛋白))进行标记。通过免疫荧光和活体成像等技术,研究上述4种疫苗在鲤巨噬细胞和体内各组织器官中的递呈和代谢作用规律。结果显示:在细胞水平,鲤巨噬细胞对SWCNTs-MG的摄取量显著高于其他疫苗组(G、MG和SWCNTs-G)(P㩳0.01);在个体水平,鲤的肾脏和脾脏对SWCNTs-MG的摄取量也显著高于其他疫苗组(P㩳0.01)。并且SWCNTs-MG可以在浸浴免疫6 h内从鳃、体表、肠道等部位进入鱼体体内,并呈递到各组织器官。4.免疫方案优化从浸浴免疫浓度(30、40和50 mg/L)、免疫密度(8、24和48尾/L)和免疫时间(6、12和24 h)这3方面对免疫方案进行优化。通过血清抗体效价变化和病毒攻毒对不同的免疫方案进行评估。结果显示:最高的免疫保护率为84.38%,相对应的免疫方案为免疫浓度40 mg/L、浸浴密度8尾/L、浸浴时间12 h;最低的免疫保护率(51.04%)对应的免疫方案为免疫浓度50 mg/L、浸浴密度48尾/L、浸浴时间6 h。综合各因素考虑,最优的免疫方案为:免疫浓度30 mg/L,浸浴密度24尾/L,鲤经疫苗浸浴免疫12 h,保护率可达83.33%。综上所述,本论文构建的靶向性碳纳米管载疫苗系统主要是通过提高疫苗进入鱼体内的含量并增强对抗原呈递细胞的提呈来提高对鲤的免疫保护,实现对SVC的高效防治。该项研究成果不但可以为水产动物靶向性纳米载疫苗系统的应用提供理论依据和研究模板,而且也对保障水产品安全、生态安全和水产养殖健康发展具有重要的意义。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S943

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