传染性造血器官坏死病毒G蛋白潜在N-糖基化位点的突变对病毒毒力和免疫原性的影响

发布时间：2020-06-23 14:32

【摘要】：传染性造血器官坏死病毒(IHNV)是弹状病毒科、诺拉弹状病毒属成员,可引起鲑科鱼类稚鱼和幼鱼的造血器官出血和坏死。传染性造血器官坏死病广泛流行于北美、欧洲和亚洲各国,已成为世界性鲑鳟鱼病,给鲑鳟养殖业带来重大经济损失,迄今为止,针对IHN尚无有效的治疗方法,因此,深入探讨IHNV的毒力及免疫原性为研究其致病机制和免疫机理提供科学而有力的依据。IHNV基因组为不分节段的单股负链RNA,大小约11 kb,编码5种结构蛋白和1种独特的非结构蛋白。分别为核衣壳蛋白N,磷酸化蛋白P,膜基质蛋白M,囊膜糖蛋白G,非结构蛋白NV和RNA聚合酶大蛋白L。其中G蛋白既是糖蛋白,又是病毒的毒力蛋白,含有病毒主要的抗原决定簇,刺激机体产生中和抗体,在病毒致病性和免疫应答等方面发挥重要作用。囊膜蛋白的糖基化是病毒在繁衍进程中出现的一个普遍现象,糖基化位点的改变可以影响病毒蛋白的折叠及构象,从而影响病毒的复制及在机体中的免疫原性。为了研究IHNV G蛋白的糖基化对病毒毒力及免疫原性的影响,本研究通过在线软件预测出G蛋白4个潜在的糖基化位点,分别将wtIHNV HLJ-09株的G蛋白第56位、379位、401位和438位氨基酸的天冬酰胺N突变为丙氨酸A,再三点联合突变和四点联合突变,通过酶切、测序等方法确证突变成功。通过反向遗传技术,拯救9株重组病毒,拯救出的病毒对CHSE-214细胞出现明显的致细胞病变效应(CPE)。通过RT-PCR鉴定、分子标识的鉴定、电镜观察以及间接免疫荧光检测等都检测到了重组病毒;用G蛋白多克隆抗体通过Western Blot鉴定对重组病毒的糖基化进行分析,证明了预测的4个位点是wtIHNV HLJ-09G蛋白的糖基化位点,并且通过突变糖基化位点氨基酸达到去糖基化的目的。对重组病毒的生物学特性做了研究,一步生长曲线显示重组毒rIHNV-N56A-N401A-N438 A、rIHNV-N379A-N401A-N438A 和 rIHNV-N56A-N379A-N401A-N438A 在 CHSE-214 细胞上的复制能力明显低于其它重组毒和亲本毒,说明同时突变G蛋白第401和438两个氨基酸时会很大程度地降低病毒的复制能力。9株重组毒和亲本毒对EPC、CHSE-214和RTG-2易感细胞的嗜性相同,都是在CHSE-214中复制最快,在RTG-2中复制最慢。在这三种细胞系上,9株重组病毒的滴度水平上呈同样的趋势,可见不同重组病毒体外复制能力的差异是由病毒本身引起的,与细胞系种类无关。将鉴定正确的9株重组病毒对1g的虹鳟稚鱼做了累积致死率的比较,结果显示只有rIHNV-N438A组在30d内的累积死亡率低于50%,表明单独突变第438位氨基酸可降低病毒对虹鳟的致死率。通过对死亡虹鳟的组织病理观察,看到9株重组毒都能使虹鳟的肝、肾、心等组织发生典型病变。用荧光定量PCR方法检测被各重组毒攻毒后虹鳟肝肾组织的病毒拷贝数,结果显示同样是IHNV-N56A-N401A-N438A、rIHNV-N379A-N401A-N438A 和 rIHNV-N56A-N379A-N401A-N438A 的拷贝数最低,表明当 G 蛋白第401和438两个氨基酸联合突变时也会降低病毒在体内的复制能力。将各重组毒及亲本毒分别免疫平均体重10g健康的虹鳟幼鱼,在免疫后第14d、28d、42d和56d分别尾静脉采集各组虹鳟血清,ELISA检测血清中特异性IgM的效价,结果表明重组病毒能诱导虹鳟机体产生特异性IgM,其中将G蛋白第438位氨基酸单独突变后能使特异性抗体IgM提前产生,推测第438位氨基酸的糖基化可能和病毒的免疫逃逸现象有关,也推断出这与导致虹鳟致死率降低有关。对rIHNV-N438A组30d未死亡的虹鳟再次攻击亲本毒后,30d内的累积死亡率为25%,可见经重组毒免疫后的虹鳟对亲本毒具有一定的抵抗能力。本研究证实了糖基对病毒的重要影响,为研究传染性造血器官坏死病毒的致病机理和免疫机理提供依据,同时为该病减毒活疫苗的研制奠定了坚实的基础。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S941.41
【图文】：

首先通过重叠延伸ＰＣＲ的方法将相应的位点在Ｆ２和Ｒ段上进行定点突变，然后，逡逑在中间载体ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ邋ＩＩ邋ＳＫ－Ｆ５４３２１６上将Ｆ２和Ｆ３段进行替换，最后将整个ｃＤＮＡ双酶逡逑切下来，插入到真核表达载体ｐＣＩ中。构建策略如图２－１，表２－２：逡逑１４逡逑

３．１邋Ｇ蛋白潜在糖基化位点的预测结果逡逑根据在线软件邋ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／邋ＮｅｔＮＧｌｙｃ邋ｓｅｒｖｅｒ邋，预测出邋Ｇ邋蛋白邋４邋个潜在逡逑的糖基化位点，分别是ａａ５６？５９、ａａ３７９？３８２、ａａ４００？４０４和ａａ４３８？４４１。预测结果如图３－１逡逑Ｈａｍｃ：逦Ｓｅｑｕｅｎｃｅ逦Ｌｅｎｇｔｈ：逦５０８逡逑ＩＤＩＴＩＩＴＰＬＩＬＩＬＩＴＣＧｉＪｌＳＱｒｙＱＳＤＴＡＳＥＳＤＱＰＴ￥ＳＩｌＰＬＦＴＹＰＥＧＣＴＬＤＩＬＳＩ７ＨＡ．ＳＱＬＲＣＰＲＩＦＤＤＥＨＲＧＬＩＡＹ？ＴＳＩ逦８０逡逑ＲＳＬＳＶＣＲＤＬＧＤＩＨＴＱＧｉｍｎｉＴＬＹｌｌＩＩＣＳＴＧＦＦＧＧＱＩＩＥＩＶＬｙＥＭＫＬＳＩＲＥＡＧＡＴＤＴＴＴＡＡＡＬＹＦｒＡＰＲＣＱｒＴＴＤＦｙＱＨＤ逦１６０逡逑ＬＩＦＴＴＴＴＱＩＳＶＬＲＤＰＹＴＲＤＦＬＤＳＤＦＶＣＧＫＣＴＫＳＰＣＱＴｆｆｆＳｍＴＩＧＤＡＧＩＰＡＣＤＳＳＱＥＩＫＣＨＬＦＹＤＩＩＳＩＫｍＡＴＳＹＧｎ逦２４邋０逡逑ＨＰＩＧＬｎＲＡＣＩＩＥＦＣＫＧＱＴＩＲＴＤＬＣＤＬＩＳＹＶＴＨＳＧＳＹＴＬＳＦＰＩＣＥＤＫＴＹＧＩＫＧｉｒＬＤＤＦＡＴＬＤＥＬＶＩＡＳＥＳＲＥＥＣＬＥＡＪＩＡＥＩ逦３２０逡逑ＩＳＴＩＳＹＴＰＴＬＬＳＫＦＲＳＰＨＰＣＩＨＤＶＴＡＩＨＫＧＳＩＴＨＧＩＣＩＴＹＴＹＤＥＶＳＫＤＲＩＴＴＫＡｉｎｉＡＩｌ

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本文编号：2727468