哈维氏弧菌及其灭活疫苗对美洲黑石斑免疫和保护效果的研究

发布时间：2020-06-23 13:07

【摘要】：近年来,随着石斑鱼养殖业的不断发展,我国的石斑鱼养殖产量已经接近10万吨。随着养殖规模不断扩大,各种细菌性、病毒性、寄生虫等疾病频发,造成石斑鱼大量死亡,给石斑鱼养殖产业造成严重的经济损失。其中,哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是引起石斑鱼病害中最重要的病原之一。本文利用从患病的美洲黑石斑中分离鉴定得到的哈维氏弧菌CJG-1株,对其生长特性以及制备灭活疫苗的最佳条件进行探究,利用哈维氏弧菌感染美洲黑石斑,探讨对美洲黑石斑(Centropristis striata)血清指标和组织中的相关免疫基因表达的影响,以及制备全菌灭活疫苗对美洲黑石斑进行免疫实验,探究对免疫相关基因在不同组织中的免疫应答影响,最后通过人工感染实验检测疫苗对美洲黑石斑的免疫保护效果,主要内容如下:(1)对CJG-1哈维氏弧菌进行活化培养,条件180 rpm、28℃进行培养,定时检测菌液浓度,得出哈维氏弧菌CJG-1株的对数增长期为4-12 h;利用活化培养12h的菌液制备全菌灭活疫苗,甲醛浓度设置梯度为0、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%,分别放置在4℃、28℃条件下,灭活24h,经疫苗质量和安全性检测后,得到灭活疫苗最佳条件为甲醛浓度0.2%,28℃,灭活24h。(2)对美洲黑石斑腹腔注射0.2ml,1×10~8 cfu/ml的CJG-1哈维氏弧菌菌液,进行人工感染试验,测定0h(感染前)、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、96h血清中的溶菌酶、碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶等生化指标,结果显示4种酶活性均不同程度地升高且显著高于对照组,说明美洲黑石斑在受到病菌感染时,机体抗感染的各项指标均增强来抵抗相关的损害因子对机体的伤害。(3)人工感染后,在0h(感染前)、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、96h共9个时间点,静脉取血后,快速解剖取脾脏、头肾、肝脏、鳃4种组织于装有RNA保存液的离心管中,用于后期RNA提取并反转成cDNA,利用Primer Premier5.0软件设计TLR2、MyD88、HSP70的特异性引物,以β-action为内参,采用RT-PCR技术,检测3种基因在4种组织中的相对表达量,结果显示,TLR2和MyD88在脾脏和肝脏中上调倍数最显著,分别为9.3和21倍以及9.9和5.9倍,头肾中的MyD88在6h时迅速上调至峰值2.3倍,鳃中MyD88在36h时上调8.3倍;头肾与鳃中的HSP70反应迅速,在18h上调至最大倍数为11.2和10.7倍,肝脏和脾脏分别在72h时上调至最大倍数9.7和2.8倍,说明TLR2、MyD88、HSP70参与了哈维氏弧菌感染的免疫应答,此外也说明,除了头肾和脾脏,肝脏和鳃在免疫应答过程中也是重要的检测评价组织。(4)在甲醛浓度为0.2%,28℃条件下,对哈维氏弧菌CJG-1株灭活24h,制得全菌灭活疫苗,对美洲黑石斑腹腔注射0.2ml,1×10~9cfu/ml的疫苗,在0h(免疫前)、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、96h共9个时间点,取组织脾脏、头肾、肝脏、鳃保存在RNA保存液中用于后期荧光定量PCR检测TLR2、MyD88、HSP70相对表达量。2周后同样剂量和方式加强免疫一次,第4周进行用1×10~8cfu/ml的哈维氏弧菌菌悬液进行攻毒。结果显示得出TLR2和MyD88在头肾和肝脏中上调趋势显著,其中MyD88在36h出现峰值为73.2和95倍,肝脏中的TLR2在24h上调至最大62.倍,头肾在36h峰值达到144.4倍,HSP70在脾脏、头肾、肝脏、鳃中均在18-48h之内表达量出现峰值,其中头肾在48h上调为对照组的6.2倍,肝脏在18h时上调为对照组的6.6倍;攻毒试验结果显示免疫后的美洲黑石斑获得了较强的免疫保护力,其相对保护率为85.71%,因此,从分子研究角度对免疫基因表达分析说明TLR2、MyD88、HSP70这3种基因参与到美洲黑石斑免疫应答过程中,良好的免疫保护率也说明疫苗免疫刺激能提高机体的免疫力,本实验制备的灭活疫苗对美洲黑石斑的免疫保护是有效。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S943
【图文】：

头肾,脾脏,黑石,美洲

32图 5-1 美洲黑石斑感染哈维氏弧菌后脾脏（A）、头肾（B）、肝脏（C）、鳃（D）中 TLR2 的相对表达量Fig.5-1 Expression of TLR2 in spleen(A), head kidney(B),liver(C) and gills(D) 0f Centropristisstriata infected by Vibrio harveyi*表示不同时间点的表达量与对照组之间有显著性差异（P＜0.5），下同。Therewas asignificant differencebetween the expression at different time points and the controlgroup (P<0.05)，thesameas below.5.7.3 Myd88 在脾脏,头肾，肝脏和鳃中的表达脾脏中的 Myd88 在受感染后 6h 迅速上调为对照组的 2 倍，在 36h 时上调达到最大为对照组的 9.3 倍（图 5-2A）；在头肾中也是在 6h时迅速上调至 2.3 倍，达到最大值，36h和 72h时显著上调（P＜0.5），其他各时间点变化不显著（图 5-2B）；

头肾,脾脏,黑石,美洲

除 48h和 96h差异不显著外，其他各时间点平均上调为 2-3 倍（图 5-2C）；（图5-2D）中可以看出，24-48h内显著上调（P＜0.5），在 36h时达到最大，为对照组的 8.3 倍，其他各时间点变化不显著。图 5-2 美洲黑石斑感染哈维氏弧菌后脾脏（A）、头肾（B）、肝脏（C）、鳃（D）中 Myd88的相对表达量Fig.5-2 Expression of MyD88 in spleen(A), head kidney(B),liver(C) and gills(D) 0fCentropristis striata infected by Vibrio harveyi5.7.4 HSP70 在头肾，肝脏，脾脏和鳃中的表达从图5-3A可以看出，HSP70在脾脏中的相对表达量及变化情况，受到感染后，6h表达量显著升高（P＜0.5）

【参考文献】