IHNV-G蛋白原核表达、抗体制备及在IHNV检测中的应用

发布时间：2020-06-26 08:37

【摘要】：传染性造血器官坏死病(Infectious Hematopoietic Necrosis,IHN)是经常出现在鲑鳟鱼科中,极其容易造成一些鲑鳟鱼发生急性病毒性死亡的严重的鱼类传染病。该类传染病死亡率极高,尤其在鱼苗中危害极广。已有研究表明,传染性造血组织坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)呈子弹状,被分类为弹状病毒科(Rhabdoviridae)、诺拉弹状病毒属(Novirhabdovirus),基因组为单股负链RNA。IHNV-G蛋白被证实表面有囊膜结构。IHNV-G蛋白作为一种免疫原,进入机体后,可引发机体的免疫应答,从而导致特异性抗体的产生及释放,抗体可以与IHNV-G蛋白发生特异性结合。本实验从GeneBank上检索到59个IHNV的G蛋白基因,经过比对,我们在保持氨基酸序列不变、读码框整体正确的条件下,人为进行调整。最后我们选择保守密码子进行整体优化,Kpn I和Sal I酶切位点分别添加在序列两端,His标签添加于N端,最终确定一条总长1545bp IHNV-G蛋白的序列。合成得该序列,再将原核表达载体pET-30a与这个基因序列连接,pET-30a-IHNV-G是合成的重组表达质粒。对pET-30a-IHNV-G进行PCR、双酶切和测序等验证,经过确定后的重组质粒转化到BL21(DE3)plySs中,再通过诱导使重组菌表达,IHNV-G蛋白表达情况通过蛋白免疫印记实验进行验证。保证其他条件不变,分别在诱导时间、诱导剂浓度等方面来优化表达条件,借此来获得该蛋白发酵的最佳工艺。利用超声破碎将菌体裂解离心后,将上清液和沉淀物分别收集,进行SDS-PAGE分析,最终得以确认IHNV-G蛋白的是以包涵体的形式表达。包涵体收集之后,首先洗涤,再变性和复性之后,分离纯化目的蛋白,除盐冻干后,获得IHNV-G蛋白。利用该蛋白切胶回收对白兔进行免疫,获得抗体,进而建立间接酶联免疫方法检测传染性造血器官坏死病毒。研究结果:实验顺利的构建了重组质粒pET-30a-IHNV-G。经过IPTG诱导后,阳性重组菌株表达出IHNV-G蛋白。保证其他条件不变,在1 mmol/L诱导物、37℃条件下发酵4 h达到最佳效果,IHNV-G蛋白以包涵体形式表达,平均1 L发酵液纯化后得到7 g菌体及0.2~0.3 g蛋白干粉。纯化蛋白复性后进行动物免疫获得的抗体,应用间接ELISA技术,检测到抗血清对IHNV-G和IHNV的效价分别达到1:32000和1:16000,与其它对照病毒无交叉反应。与PCR检测结果符合率达到98%。结论本文建立的间接酶联免疫法方法具有良好的灵敏性和特异性,为IHNV的检测提供了快捷、高效的技术手段。为进一步建立传染性造血器官坏死病毒感染的胶体金免疫试纸条快速检测方法奠定了理论和实验基础。
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S941.414
【图文】：

pMD-18重组质粒

pET30a质粒

【参考文献】

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本文编号：2730089