浙江沿海典型大型藻类资源活性物质利用研究

发布时间：2020-06-28 09:19

【摘要】：我国大型藻类资源分布广、种类多,在海洋生态系统和气候环境等方面发挥着重要作用。由于大型藻类的次生代谢产物在抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等方面表现出显著的生物活性,对大型藻类活性物质的研究一直以来都是各国研究的热点,大型藻类活性物质在食品、保健品、医药、化工等领域得到广泛应用。大型藻类资源活性物质利用研究有利于发现新的活性化合物,深化藻类活性物质作用机理的认识,提高藻类资源利用价值,推动藻类活性物质在生物医药上的应用及藻类栽培渔业发展。浙江沿海大型藻类资源丰富,但目前对其研究和利用存在不足。所以本文以浙江沿海典型大型藻类作为研究对象,于浙江沿海4个采样点系统采集33种藻类作为实验样本;利用5种溶剂提取海藻活性物质,之后用海藻提取物进行抑菌活性、抗白斑综合征病毒(WSSV)活性和抗氧化活性筛选;分析藻类活性物质组成,进一步阐明藻类化学组成与活性之间的关联。主要研究结果如下:1.大型藻类的活性物质研究概况主要介绍了大型藻类所具有的抗肿瘤、抗病毒、抗细菌和抗氧化等重要的生物活性、活性物质及作用机理;选取浙江沿海典型大型藻类,系统地阐述其生物活性物质及开发利用研究概况。2.浙江沿海典型大型藻类活性物质的提取及抑菌活性研究(1)海藻样品的采集、鉴定及其形态特征描述。在浙江沿海的4个采样点采集海藻样品。经过形态特征观察并鉴定后,确定用于实验的藻类合计33种,其中绿藻8种、红藻18种、褐藻7种。海藻样品经清洗晒干后用于后续实验。(2)不同提取模型抑菌活性研究。选用正己烷、二氯甲烷、丙酮、85%甲醇和85%乙醇等5种提取溶剂提取海藻活性物质。采用纸碟法,利用活性提取物对革兰氏阴性菌的大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、香鱼假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus);革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等5种细菌进行抑菌实验。实验结果表明,不同提取溶剂对藻类提取物的抑菌活性影响显著,藻类有机溶剂提取物均表现出不同程度的抑菌活性。同时,研究表明海藻提取物抑菌活性是提取方法、活性物质纯度以及对象菌株等多个因素共同作用的结果。但鉴于乙醇溶解性能好,既能溶解亲水性活性成分,也能溶解部分亲脂性活性成分,提取活性物质更加多样化,而且成本低廉,所以本研究选择85%乙醇作为活性物质提取溶剂。(3)海藻乙醇提取物的制备及抑菌活性筛选。海藻样品通过85%乙醇浸提后获得活性提取物,利用活性提取物对5种供试菌株开展抑菌实验研究。结果表明,除刺松藻乙醇提取物无抑菌效果外,其他藻类的乙醇提物均具有不同程度的抑菌活性,即97%的海藻样品显示出了抑菌活性。气生硬毛藻、多管藻、鸭毛藻、肉质蜈蚣藻、舌状蜈蚣藻、厚网藻、羊栖菜的粗提取物显示出对5种供试细菌中的4种有抑制作用。蜈蚣藻、舌状蜈蚣藻、羊栖菜等藻类提取物抗大肠杆菌活性相对较强;舌状蜈蚣藻提取物抗香鱼假单胞菌活性相对较强;龙须菜、多管藻等藻类提取物抗溶藻弧菌活性相对较强;浒苔、铁钉菜、蜈蚣藻等藻类提取物抗嗜水气单胞菌活性相对较强;龙须菜、海萝、羊栖菜、曲褶刚毛藻等藻类提取物抗金黄色葡萄球菌活性相对较强。这些具有较强抗菌活性的藻类具备良好的开发潜力,或可成为目前市场上抗生素的天然替代品。3.浙江沿海典型大型藻类抗病毒活性研究(1)藻类提取物抑制WSSV(白斑综合征病毒)感染拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)的研究。选取海萝(Gloiopeltis furcata)、龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)、孔石莼(Ulva pertusa)、浒苔(Ulva prolifera)、羊栖菜(Sargassum fusiforme)和铁钉菜(Ishige okamurai)等6种海藻的85%乙醇提取物用于实验。按照实验拟穴青蟹的体质量分别注射藻类提取物溶液,提取物浓度梯度为1mg/kg、5 mg/kg和10 mg/kg,观察并记录藻类提取物对感染WSSV拟穴青蟹累计死亡率的影响。结果显示,感染WSSV的拟穴青蟹死亡率非常高,在没有干扰的条件下204h全部死亡。羊栖菜提取物可以显著降低感染WSSV拟穴青蟹的死亡率,而其他藻类提取物效果不明显。(2)藻类提取物对拟穴青蟹免疫活性影响的研究。拟穴青蟹注射藻类提取物24h后,抽取其血淋巴液用于总血细胞计数(total hemocyte count,THC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、酚氧化酶(PO)活性等免疫活性分析。研究表明羊栖菜、龙须菜、孔石莼和海萝等藻类提取物显著提高了拟穴青蟹的免疫活性,有效增强机体对WSSV的防御作用。其中,羊栖菜提取物对拟穴青蟹各项免疫指标的提升作用最明显,并且与之前WSSV感染青蟹存活实验结果一致。海藻提取物对健康拟穴青蟹和WSSV感染拟穴青蟹的免疫活性都有改善,说明海藻可以成为水产动物良好的免疫增强剂,同时可以开发成为抗WSSV药物,这将为水产动物病害防治提供一个更加安全的解决方案。4.浙江沿海典型大型藻类抗氧化活性研究(1)藻类总多酚含量分析。进行藻类多酚物质的提取和含量测定,结果表明,不同海藻样品总多酚含量差异显著,其中,龙须菜、铁钉菜、羊栖菜等藻类提取物中多酚含量较高,尤以龙须菜多酚含量最高。分析表明藻类多酚含量受藻类样品采样季节、采样地点、采样部位以及提取方式等多种因素影响。由于多酚具有多种显著的生物活性,所以多酚含量高的龙须菜、铁钉菜、羊栖菜等藻类具有开发成天然抗氧化剂的应用前景。(2)藻类提取物抗氧化活性研究。通过对33种藻类清除DPPH和ABTs自由基活性的测定,筛选出抗氧化活力强的藻类,同时对不同提取方式造成海藻提取物抗氧化活性的差异、抗氧化能力与多酚含量的相关性以及抗氧化能力与抗菌活性的相关性等进行研究。结果表明,所有藻类提取物均显示出抗氧化活性,其中铁钉菜、多管藻、鸭毛藻等藻类抗氧化活性较强,尤以铁钉菜抗氧化活性最强。研究同时发现,提取溶剂对活性提取物的抗氧化活性影响显著,说明抗氧化活性物质的提取需要考虑不同藻类的主要成分来选择提取溶剂,同时也反映出抗氧化活性是藻类多种成分共同作用的结果。多酚含量与抗氧化活性显著相关,所以多酚含量可以在一定程度上作为藻类抗氧化活性筛选的标准。研究还发现,藻类提取物抑菌活性(抑菌种数)与ABTs自由基清除活性存在相关性,所以推论,藻类提取物ABTs自由基清除率的高低在一定程度上可以反映出该藻的抗菌活性。5.浙江沿海典型大型藻类活性物质分析(1)大型藻类活性物质分析。海藻具有多种生物活性与其所含有的多糖、多酚、脂肪酸和其他活性成分有关,以浙江沿海典型大型藻类为研究材料,分别对其含有的叶绿素、类胡萝卜素、水溶性多糖等成分进行了测定,并通过ABTs自由基清除实验分析色素的抗氧化活性。结果表明藻类样品中可溶性多糖、色素等物质含量差异显著。可溶性多糖含量范围从6.07±0.80 mg/g到89.81±2.29 mg/g,其中粗枝软骨藻、多管藻、铁钉菜多糖含量较高。不同海藻的总色素含量差异明显,范围从1.78±0.06mg/100g至186.33±7.06mg/100g,总体上绿藻的总色素含量最高,褐藻的总色素含量最低,其中海绿色刚毛藻和羽状羽藻总色素含量显著高于其他藻类。本研究还表明,海藻色素具有抗氧化作用,尤其是铁钉菜色素提取物的抗氧化活性最强。(2)大型藻类GC-MS化学成分分析。用气相色谱/质谱联用技术(GC-MS)对浙江典型大型海藻的挥发性化合物进行分析和结构鉴定,并阐明其生物活性。结果表明种藻类化合物组成存在较大差异。藻类挥发性化合物中有较多活性成分,本研究还在几种藻类中发现了β-ionone、Benzaldehyde和1-octen-3-one等抗菌活性化合物。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.3
【图文】：

孔石莼

E122°46′3.25″裂叶马尾藻 S. siliquastrum 2017 年 4 月枸杞岛N30°43′1.64″E122°46′3.25″海藻样品形态特征及分布仔细观察并记录采集到的海藻样品的形态特征，参考《浙江大型海藻彩色图毛欣欣等编著，科学出版社 2011 年第一版）、《浙江海藻原色图谱》（浙江科术出版社 1983 年 6 月第一版）进行种类鉴定。孔石莼（U. pertusa）隶属绿藻门，绿藻纲，石莼目，石莼科，石莼属，广泛于我国的辽宁、河北、山东、江苏、浙江、福建、广东等地潮间带的礁石上采于舟山枸杞岛，潮间带礁石表面分布较多。孔石莼藻体呈绿色，叶片形状则并有形状、大小不一的孔洞。采样图片见图 2-1 所示。

浒苔,石莼

图 2-2 浒苔Fig. 2-2 U. prolifera）隶属于绿藻门，绿藻纲，石莼目，石莼海，黄海、渤海沿岸亦有少量分布，样品布密集，资源量较大。藻体呈片状，黄绿图 2-3 石莼Fig. 2-3 U. lactuca

【参考文献】