瓦氏黄颡鱼（Pelteobagrus vachelli）应对低氧胁迫的分子机制研究

发布时间：2020-06-28 09:44

【摘要】：在水生生态系统中,由于季节变化、光合作用、风、盐度、温度、昼夜变化等自然因素以及环境污染、水体富营养化和全球变暖问题等人为因素的存在,氧气含量可在时间和空间上发生剧烈变化。此外,在常见的高密度、浅池塘水产养殖过程中,高养殖密度以及高营养输入导致增殖的浮游动植物引发水华,使得水体溶解氧含量低且不稳定,成为鱼类养殖的一个巨大威胁。虽然鱼类已经具备了在低氧水域环境下存活的能力,但是这种生存能力是依赖于一套完整的氧气感受、基因-蛋白互作调控等应对机制。目前低氧胁迫研究已经成为鱼类生理学的热点之一,然而关于瓦氏黄颡鱼应对低氧胁迫的分子调控机制的研究未见报道。瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)是黄颡鱼属鱼类中个体最大的一种,最大个体体质量达1850g,但是该鱼耐低氧能力较黄颡鱼差,连续阴雨天气、密度过高等导致的低氧会致使其死亡,该鱼在我国高密度池塘养殖较少,但其具有生长速度快、食性杂、容易驯养、肉味鲜美等优点,同样也是水产养殖业一个很有养殖前景的品种,而且在日本、韩国、东南亚等国家也有巨大的市场潜力,是出口创汇的优良品种。目前,瓦氏黄颡鱼产业已初具规模,迫切需要培育耐低氧新品种,这也是瓦氏黄颡鱼养殖业可持续发展的必要条件。然而至今为止,该物种只有少数EST和蛋白质序列可用,遗传资源的缺乏严重阻碍了其在分子育种以及特定生物学过程中的深入研究。可见,瓦氏黄颡鱼的这些特征表现出它不仅仅是一个具有较高的营养和经济价值的水产养殖品种,而且是一个潜在的可以用来研究低氧和再氧化分子调节机制的模型物种。本论文以瓦氏黄颡鱼为实验对象,一方面,运用第二代测序技术对低氧胁迫前后(溶氧量0.7 mg/L; 4h)瓦氏黄颡鱼肝脏的转录组、miRNA组、蛋白质组进行联合和对比研究;另一方面,研究了低氧胁迫(溶氧量0.7mg/L; 1.5h, 4h, 6.5h)和恢复下(溶氧量6.8mg/L; 1.5h, 4h, 6.5h)对瓦氏黄颡鱼氧传感蛋白、呼吸代谢及血液指标的影响,同时在低氧胁迫和恢复下对瓦氏黄颡鱼氧化应激参数进行分析,期望在分子水平上系统地阐明鱼类应对低氧胁迫的分子调控机制,也为今后开展鱼类耐低氧新品种选育提供一定的理论依据。本论文研究结果主要包括以下4个部分:1.低氧胁迫下瓦氏黄颡鱼肝脏mRNA-seq和miRNA-seq联合分析(转录水平)通过miRNA组和转录组测序分析低氧胁迫前后瓦氏黄颡鱼肝脏共获得18个差异miRNA和961个差异mRNA,结合miRNA预测的靶基因进行联合分析后共获得162个 negative miRNA-mRNApairs,包括 18 个差异 miRNA 和 107 个 mRNA。对所涉及到的转录组和联合分析的差异基因进行KEGG pathway富集性分析,根据数据的综合分析以及对 21 个差异基因(PFKL、HK、LDH、PGAM、LPL、BCL2、Vhl、TFRC、SLC2A1、VEGF、EPO、DAPK、JUN、ANGPTL4、CA、PRKAG2、ATF2、CREM、IRS、Akt 和 DUSP8)和 13 个差异 miRNA (miR-143、miR-17、miR-27b、miR-301c、miR-338、miR-3618、miR-210、PC-3p-36625_60、PC-5p-83983_9、miR-338、miR-16a、miR-20a和miR-301a)进行qRT-PCR验证,结果显示瓦氏黄颡鱼为了在急性低氧条件下维持正常的生理活动,在转录水平上通过miRNA-mRNApairs调控一些重要的信号通路(如 HIF-1 signaling pathway、Glycolysis/Gluconeogenesis、AMPK signaling pathway等)并导致一系列生物学过程,包括促进血红细胞增殖,促进血管生成,抑制细胞凋亡;有氧代谢和无氧代谢的转换;减少能量消耗和生物合成。2.低氧胁迫和恢复对瓦氏黄颡鱼氧传感蛋白、呼吸代谢及血液指标的影响以HIF-1 signaling pathway为主线,系统地开展瓦氏黄颡鱼低氧胁迫下大脑和肝脏组织相关基因、蛋白、酶活性的时序表达研究,通过qRT-PCR分析发现氧传感蛋白(HIFs、PHDs、FIH和Vhl)在肝脏或大脑中表达较高。在低氧胁迫和恢复条件下,氧传感蛋白mRNA表达量和HIF-1α蛋白表达量都显著上调,这些氧传感蛋白(尤其是HIF-1α)可以作为环境低氧的分子指标;同时,在低氧下上调的PHDs可能在恢复下反馈调节HIFs以终止低氧反应;瓦氏黄颡鱼在低氧和恢复下:通过提高RBC、HB和SI来增加血液携带氧气的能力,通过提高糖酵解相关酶活性(PFK、HK和PK)和无氧呼吸关键酶(LDH)来增加无氧呼吸能力,同时低氧下在肝脏组织中降低了有氧呼吸酶活性(CS)来抑制有氧呼吸。以上生物学过程是瓦氏黄颡鱼为了应对低氧和恢复下能够进行正常生命活动获取能量所作出的代谢改变,代谢模式为有氧呼吸至无氧呼吸的转变。3.低氧胁迫下瓦氏黄颡鱼肝脏差异蛋白质组学分析(翻译水平)通过基于iTRAQ的蛋白质测序分析低氧胁迫前后瓦氏黄颡鱼肝脏共获得511个差异蛋白,在对511差异表达蛋白的KEGG pathway富集性分析中,“Metabolism”是被富集到最多的生物学过程大类别,包括几个重要的生物学过程小类别“Xenobiotics biodegradation and metabolism”、“Lipid metabolism”、“Carbohydrate metabolism”和“Amino acid metabolism”几个子类。值得注意的是一些重要的pathway同样被富集到,如 Peroxisome (属于“Transport and catabolism” pathway 小类别)和 PPAR signaling pathway (属于“Endocrine system” pathway小类别)。根据在翻译水平上数据的综合分析以及对 6 个差异基因(PCK1、TGL2、MGEA5、PGAM1、UGT2A2、HYI)和 6个差异蛋白(PCK1、PGAM1、TGL2、TAT、PGK1、MDH1)的验证,结果表明瓦氏黄颡鱼肝脏低氧适应生物学过程是Peroxisome和PPAR signaling pathway主导过氧化物的降解和代谢以及脂质代谢,另外代谢模式为有氧代谢至无氧代谢的转换以及减少能量消耗和生物合成。4.低氧胁迫和恢复对瓦氏黄颡鱼氧化应激损伤和抗氧化系统的影响为了探究低氧胁迫和恢复对瓦氏黄颡鱼氧化应激损伤和抗氧化系统的影响,首先对瓦氏黄颡鱼SOD1和SOD2基因的cDNA全长进行序列分析以及组织表达进行分析,结果表明SOD1在肝脏中表达最高,而SOD2在心脏和大脑中表达较高。然后对瓦氏黄颡鱼在低氧胁迫和恢复中SODs基因和蛋白的表达水平进行系统研究,同时对氧化应激参数(MDA、CP和LPO)及抗氧化酶(GR、CAT、GST、GPx和SOD)进行检测,结果表明在瓦氏黄颡鱼肝脏中抗氧化酶(CAT、GST、GPx和SOD)在机体面临氧化应激之前逐渐升高,与M. Hermes-Lima提出的猜想“氧化应激准备”相一致。在瓦氏黄颡鱼大脑中,氧化应激参数(CP和LPO)在低氧胁迫下降低,而且抗氧化酶(SOD、GPx、GST、GR)也显著降低,表明了环境低氧导致瓦氏黄颡鱼大脑组织中新陈代谢减痕以减少ATP的利用,从而减少线粒体呼吸链上电子的携带和残留氧气分子的电子传递以减少ROS的水平,减少氧化应激对大脑的负面影响,这也验证了鱼类在低氧下,为保护心脏或大脑这类对生存起重要作用的组织,血液会重新分配以保证这些组织在低氧状态下能够维持基本生存。在恢复条件下,瓦氏黄颡鱼肝脏和大脑中氧化应激参数及抗氧化酶都显著升高,这表明了伴随着大量氧气的输入导致代谢补偿,ROS的浓度迅速上升,因而出现了恢复过程中的氧化应激现象。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4
【图文】：

ＤＮＡ在ＲＮＡ聚合酶的作用下转录成前提ｍＲＮＡ邋（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ），之后ｐｒｅ－ｍＲＮＡ要逡逑经过５’端加帽子以及３’端加尾，ｍＲＮＡ剪接（ｍＲＮＡ邋ｓｐｌｉｃｉｎｇ），即ｍＲＮＡ前体去除逡逑掉内含子而保留外显子的修饰过程（中心法则见图１．２）。转录组研究是基因功能及结逡逑构研究的基础和出发点，了解转录组是解读基因组功能元件和揭示细胞及组织中分子逡逑组成所必须的，并也对理解机体发育和疾病具有重要作用。逡逑Ｃｅｎｔｒａｌ邋ｄｏｇｍａ邋ｏｆ邋ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｂｉｏｌｏｇｙ邋￣娜。哪邋ＢａｓｅＰａｉｒ逡逑＼邋：－／逡逑Ｇｅｎｏｍｅ逦ｉｊ逡逑．．？？＊＂＊邋ｃ邋＼邋Ｕ逡逑Ｚ逦＿邋Ｅｘｏｎ逡逑Ｇｅｎｅ邋逦（邋＂邋１邋１逦邋１．１逦ｈ：七邋ｌ｜ｌ；ｉ逦ａ逦炫找Ｕｉ邋逡逑Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋｜｜逦、、ｉｍｒｏｎ邋Ｚ逡逑§邋ｐｒｅ－ｍＲＮＡ邋ｉ逦Ｉ￣——逦Ｉ邋ｆｍ邋微逡逑￡逦Ｓｐｌｉｃｉｎｇ邋ｊｊ逦Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ邋Ｓｐｌｉｃｉｎｇ邋｜Ｊ逡逑ｃｄ邋ｍＲＮＡ逦ｌ逦（逦，ｉ，，：，：，邋：］ｉｗ：：｜逡逑Ｑ＞逡逑Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ邋ｊｊ逦Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ邋｜｜逡逑ｐｒ0，ｅｉｎ逡逑图１．２分子生物学的中心法则逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｔｈｅ邋ｃｅｎｔｒａｌ邋ｄｏｇｍａ邋ｏｆ邋ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｂｉｏｌｏｇｙ逡逑根据所研宄物种是否有参考基因组以及注释信息，转录组测序可分为有参转录组逡逑和无参转录组测序两种类型。对于有参转录组测序，通过将测序ｒｅａｄｓ映射到参考基逡逑因组上

Ｆｉｇ．邋２．２邋Ａ邋ｆｌｏｗ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｃＤＮＡ邋ｌｉｂｒａｒｙ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ｍｉＲＮＡ－ｓｅｑ逡逑２．２．３转录组测序数据质量预处理和Ｔｒｉｎｉｔｙ拼接逡逑１．数据质量预处理逡逑通过高通量测序仪获得的ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ原始数据（２＞＜１２５ｂｐ），其中可能含有带接头逡逑的（建库过程引入）和低质量的测序数据（由测序仪器本身产生）。为了确保准确、逡逑可信的分析结果，需要对于原始数据进行预处理，得到有效数据（Ｖａｌｉｄ邋ｄａｔａ），以用逡逑于后续的信息分析。测序数据预处理步骤如下：逡逑（１逦）去除带接头（Ａｄａｐｔｏｒ邋）的邋ｒｅａｄｓ邋：逦ＲＡ５逡逑５，ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣ逡逑ＧＡＴＣＴ－３，和邋ＲＡ５邋５，ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣ邋（ｉｎｄｅｘ）逡逑ＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’。逡逑（２）去除含有Ｎ邋（Ｎ表示无法确定碱基信息）的比例大于５％的ｒｅａｄｓ。逡逑（３）去除低质量的Ｒｅａｄｓ邋（质量值＜＝１０的碱基数占整个ｒｅａｄｓ的２０％以上。逡逑（４）统计原始测序量，有效测序量，Ｑ２０，Ｑ３０，邋ＧＣ含量。逡逑．

本文编号：2732864