鲤春病毒血症病毒糖蛋白酵母展示系统的构建及免疫保护效果初步评价

发布时间：2020-06-30 03:08

【摘要】：鲤春病毒血症(Spring virernia of carp,SVC)是由鲤春病毒血症病毒(Spring virernia carp virus,SVCV)引起的,能够造成多种鲤科鱼类大量死亡的传染性疾病。它是世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)必报的重要疫病,也是我国2008年颁布的动物疫病病种名录中的一类动物疫病。该病一般发生于春季,具有流行范围广、发病率高、死亡率高的特点,目前尚无有效的防治方法。对于病毒病的防控,疫苗一直是最为理想的选择。其中口服疫苗是当前最受欢迎的鱼用疫苗,可用于规模化免疫,解决了免疫操作工作量大、鱼苗免疫难等问题。因此,本研究拟利用酵母表面展示技术,将SVCV糖蛋白(Glycoprotein,G)展示于酿酒酵母细胞表面,口服免疫鲤鱼(10±2 g)。通过测定血清中和抗体效价、免疫相关基因表达量变化以及相对免疫保护率等指标,对所构建的酵母活载体口服疫苗的免疫保护效力进行评价。具体研究内容及结果如下:1、以SVCV shlj1分离株基因组RNA为模板,通过RT-PCR技术,体外扩增获得SVCV表面糖蛋白的基因开放阅读框(1530 bp)片段,将其克隆至酿酒酵母(EBY100)表面展示载体pYD1,构建重组质粒pYD1-G。利用电转化方法将重组质粒pYD1-G导入酿酒酵母感受态细胞,经YNB选择培养基筛选和菌液PCR的鉴定,挑选出阳性转化子,对其进行2%半乳糖诱导。利用间接免疫荧光抗体检测技术和流式细胞仪检测SVCV G蛋白的酵母表面展示情况。间接免疫荧光抗体检测结果显示,诱导后的酵母细胞EBY100-pYD1-G能产生特异性红色荧光,且随着诱导时间的增加,红色荧光的酵母细胞比例不断增加。利用Image J软件对免疫荧光镜检视野(n=10)进行分析可知,诱导0、24 h、48 h、72 h阳性酵母细胞所占比例平均值分别为8.38%、24.20%、55.30%和72.41%,且各组之间阳性酵母比例差异显著(P0.05)。流式细胞仪检测结果显示,诱导0、24 h、48 h、72 h时,酵母细胞平均荧光强度分别为2112、7086、10236、10554,酵母细胞的荧光强度与诱导时间呈正比。但诱导48 h酵母细胞表面荧光强度与诱导72 h相比差异不显著。综合间接免疫荧光抗体检测结果和流式细胞仪检测结果,本研究选取48 h为SVCV糖蛋白酵母表面展示的最佳诱导时间。2、大量制备表达SVCV G蛋白的重组酵母菌,利用无菌PBS调节菌液终浓度为1×10~9CPU/mL,用以免疫幼鲤(10±2 g),每次口服灌喂100μL。分别设置单次免疫EBY100-pYD1-G组(连续免疫7 d)、多次免疫EBY100-pYD1-G组(免疫2次,间隔7 d,每次连续免疫7 d)以及EBY100-pYD1组(单次免疫组和多次免疫组)。于免疫后的第7 d、14 d、21 d、28 d采集鲤鱼的头肾和脾脏,利用反转录实时荧光定量PCR(Reverse Transcription Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)检测组织器官中TNF-α、CD4、IgT相对表达水平;于免疫后第42d,利用上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini,EPC)检测各组鲤鱼血清SVCV中和抗体效价;于免疫后的第30d,用10~6.28.28 TCID_(50)/mL的SVCV病毒培养液,采用浓度100TCID_(50)/mL,对免疫后的幼鲤进行腹腔注射攻毒,每尾接种50μL,连续观察21 d记录鲤鱼的死亡情况,利用公式RPS=[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%,计算口服疫苗的相对保护效率,以评价重组酵母菌的免疫保护效力。免疫相关基因表达量测定结果显示,口服重组酵母菌EBY100-pYD1-G实验组中CD4、TNF-α和IgT基因表达水平均出现了不同程度的上调,各基因表达水平均呈现先高后低的趋势。CD4基因表达量于免疫后的21 d达到峰值,与对照组相比差异显著(P0.05)。免疫后第28 d,在头肾和脾脏中,多次免疫EBY100-pYD1-G组CD4表达量分别为单次免疫EBY100-pYD1-G组的3.26倍和3.19倍,差异显著(P0.05)。TNF-α基因表达量于免疫后的21 d达到峰值,与对照组相比差异显著(P0.05),且头肾中多次免疫EBY100-pYD1-G组TNF-α基因表达量显著升高,是单次免疫EBY100-pYD1-G组的3.29倍,差异显著(P0.05);在脾脏中多次免疫EBY100-pYD1-G组和单次免疫EBY100-pYD1-G组差异不显著。Ig-T基因在14 d时达到最大值,与对照组相比差异显著(P0.05),且在头肾和脾脏中,多次免疫EBY100-pYD1-G组Ig-T基因表达量出现大幅度的提高,分别是单次免疫EBY100-pYD1-G组的3.18倍和3.07倍,差异显著(P0.05)。血清中和抗体效价结果显示单次免疫EBY100-pYD1-G组和多次免疫EBY100-pYD1-G组中和抗体平均效价分别为31.9和40.6,而EBY100-pYD1免疫组鲤鱼血清中无任何SVCV中和抗体,各组之间均差异显著(P0.05)。免疫保护率分析结果显示,单次免疫EBY100-pYD1-G和多次免疫EBY100-pYD1-G的相对保护率分别为37.14%和43.24%,二者之间差异显著(P0.05)。该结果表明免疫EBY100-pYD1-G重组酵母菌能够显著降低鲤鱼的死亡率,且多次免疫组免疫效果显著优于单次免疫组。综上所述,本研究制备的SVCV酵母活载体口服疫苗能够刺激鲤鱼产生特异性和非特异性免疫应答,对抵抗SVCV侵染有显著的保护作用,有望成为预防SVCV的新型口服疫苗。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S943
【图文】：

图 1 .鲤春病毒血症病毒（carp spring virernia virus, SVCV）病毒结构、基因组结接顺序，引自 http://viralzone.expasy.org/4657Fig 1. Structure, genomic and linkage of carp spring virernia virus (SVCV1.2 SVCV 的分类特征及流行情况迄今已报道的鱼类弹状病毒（Fish rhabdovirus）有十几种，鲤春病毒（SVCV）是其中的一种，此外还包括病毒性出血败血症病毒（Viral haemsepticemia virus，VHSV）、传染性造血器官坏死病毒（Infectious hemnecrosis virus，IHNV）、日本牙鲆弹状病毒（Hirame rhabdovirus，HIRR鱼苗弹状病毒、乌鳢弹状病毒（Snakehead rhabdovirus，SHRV）、弹状病（Rhabdovirus 903/87, 903/87）、鳜鱼弹状病毒（Mandarin fish Siniperrhabdovirus，SCRV）、胭脂鱼弹状病毒（Chinese sucker rhabdovirus，C新近分离出的海鲑弹状病毒 28/97（Sea trout rhabdovirus 28/97，STRV 2[16~19]。弹状病毒科包括水泡性病毒属（Vesiculovirus）、狂犬病毒属（Lyss暂 时 热 病 毒 属 （ Ephemerovirus ） 和 粒 弹 状 病 毒 属 （ 诺 拉 弹 状 病Novirhabdovirus）。其中粒弹状病毒属是国际病毒分类委员会第 7 次报告

图 2 a 凝集素酵母表面展示系统Fig. 2 a-agglutinin-based display system和意义殖业飞速发展，集约化养殖已代替传统养殖模病害问题却是阻碍集约化养殖发展的问题之一成无法弥补的经济损失。鲤科鱼类作为我国重水养殖的 50%以上，每年产生较高的经济收

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本文编号：2734767