基于转录组和miRNAs分析中华绒螯蟹促雄腺的相关基因及其调控机制

发布时间：2020-06-30 02:24

【摘要】：中华绒螯蟹俗称河蟹、大闸蟹,是我国主要的淡水养殖蟹类。在养殖过程中,雄蟹生长快,攻击性强,容易导致雌蟹死亡;养殖后期雌蟹性早熟会降低商品规格。单性化养殖是提高中华绒螯蟹养殖效益的有效途径,因此,有必要开展中华绒螯蟹性别调控机制方面的研究,为实现单性化苗种繁育提供理论基础。促雄腺是雄性甲壳动物特有的腺体,其分泌的激素为促雄腺激素,具有调控雄性分化、维持雄性第二性征和生长调节的功能。本研究分别对增殖期和分泌期促雄腺转录组和miRNAs进行测序分析,筛选与促雄腺发育相关的基因,并预测这些基因可能参与的调控通路。克隆了中华绒螯蟹促雄腺基因(Es-IAG)的全长序列,并进行了表达分析和干扰研究,为中华绒螯蟹性别分化研究奠定了基础。利用IlluminaHiseq平台,对中华绒螯蟹增殖期和分泌期促雄腺进行转录组测序,比较转录组分析表明,两个转录组共得到72000条基因,其中差异表达基因4027条;GO分析显示,差异表达基因的功能主要集中在蛋白质的合成和分泌等生物学过程,并富集到转录、翻译及信号转导的相关通路中;进一步筛选出可能参与精巢发育及雄性性征维持的相关基因为Es-IAG,TRA-2,Cytochrome p450,SRY,和FTZ-F1;可能参与精子发生调控的相关基因为Ubiquitin、serpin、CathepsinA和CathepsinD;核糖体通路中44条基因表达显著上调,2条显著下调,说明了分泌期促雄腺中促雄腺激素的分泌量增加的原因。有3条基因被注释为胰岛素受体基因,在胰岛素信号通路中发挥重要调控作用,通过不同信号通路参与调控促雄腺细胞的增殖分化、细胞凋亡和蛋白合成。其中,Unigene10231被注释到卵母细胞成熟与减数分裂通路中,提示可能与卵细胞成熟有关,CL1931.Contig3可能是胰岛素样生长因子的受体,与生长相关。分析了刺激神经的配体受体相互作用通路,在分泌期,褪黑素受体、5-羟基色胺受体1基因的表达量显著下调,提示5-羟基色胺和章鱼胺通过促雄腺调控精巢发育;章鱼胺受体的表达量显著上调,章鱼胺与攻击、交配行为正相关,提示章鱼通过促雄腺调控雄性争斗和交配行为的机制。利用从转录组中获得的Es-IAG片段,通过RACE技术,克隆Es-IAG基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析,结果发现,中华绒螯蟹粗雄性激素的氨基酸序列与蓝蟹(C.sapdus)的序列一致性最高,为44%,其次是拟穴青蟹(S.paramamosain),相似性达42%。中华绒螯蟹促雄腺激素前体多肽中存在分泌型信号肽,说明该激素为分泌型蛋白,共存在两个糖基化位点,未发现跨膜结构域;在促雄腺激素前体多肽的C链和A链,C链和B链之间存在典型的R**R蛋白酶酶切位点,提示促雄腺激素前体多肽是在切除C链后成为成熟的促雄腺激素的,成熟肽链中的6个保守的Cys残基形成两个链间二硫键和一个链内二硫键,在三维结构上与其它甲壳动物保守位点的一致性,充分说明了甲壳类动物IAG基因的序列结构在关键位点的进化上是高度保守的。与其它已报道的甲壳动物促雄腺激素氨基酸序列做系统进化分析,发现中华绒螯蟹和蓝蟹、拟穴青蟹的亲缘关系最近,并与果蝇、厩螯蝇聚为一支。利用荧光定量PCR技术,检测中华绒螯蟹16个连续发育时期LAG基因的表达情况,包括受精卵、囊胚期、原肠期、眼点期和心跳期,以及蚤状幼体、大眼幼体和幼蟹Ⅰ～Ⅴ期雄体,结果发现,雄性Ⅰ期幼蟹体内Es-IAG基因的表达量显著升高,外部形态观察发现,Ⅰ期幼蟹开始出现性别相关附肢的分化,预示着Ⅰ期幼蟹阶段是中华绒螯蟹性别分化的关键期。根据Es-IAG基因序列设计3个SiRNA,干扰扣蟹体内Es-IAG的表达,注射24小时后,利用荧光定量PCR检测Es-IAG基因的表达情况,其中SiRNA-391的干扰效率达到67%。利用浸泡法干扰大眼幼体中Es-IAG基因的表达,能显著抑制Ⅰ期幼蟹雄性附肢的发育。利用HiSeq高通量测序技术,检测中华绒螯蟹增殖期和分泌期促雄腺中small RNA的表达情况,共筛选出已知miRNA3719条,差异表达的miRNA有2246条,其中1780条在分泌期促雄腺中的表达量显著下调,466条显著上调。预测其中Let-7可能参与了精巢的发育,以Es-IAG为靶基因的miRNA有27个,预测其中miR-197、miR-2443和miRNA-6368可能参与促雄腺的发育调控;通过GO分析,发现靶基因富集的生物学功能主要包括生物组分的合成、代谢、信号转导、细胞部分和绑定等,这些功能与促雄腺的增殖、分泌和调控功能密切相关。差异表达miRNA中,以性别发育相关基因为靶基因的miRNA,可能是参与性别发育的关键miRNA。共筛选出65个新miRNA,功能主要集中于生理调节、细胞过程、代谢过程及信号转导等生物学过程,为进一步揭示中华绒螯蟹性别调控奠定了基础。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4
【图文】：

中华绒螯蟹

＾逦－Ｊｆｃ—逡逑１刖ｇ逡逑中华线螯蟹■图１－１），俗名河蟹，属甲壳纲，十足目，方蟹科，逡逑绒螯蟹属，其适应能力强，生长速度快，营养价值高，是我国重要的淡水养殖蟹类。中逡逑华绒螯蟹自然分布于我国渤海、黄海与东海诸岸，自长江口的崇明岛到湖北省、浙江省逡逑是我国著名长江水系中华绒螯蟹的主产地，其中以阳澄湖大闸蟹品质最佳，久负盛名。逡逑自上世纪８０年代突破中华绒螯蟹人工育苗技术以来，人工养殖区不断向内陆扩大，遍逡逑布全国各地（赵乃刚等，１９８８），目前中华绒螯蟹规模化养殖区主要集中在江苏、安徽、逡逑湖北等省，２０１４年，国内总产量达到了邋７５万吨，创历史新高。经多年实践积累，中华逡逑绒螯蟹人工养殖技术和产业化模式日渐成熟，各地根据资源优势逐渐形成了苗种繁育、逡逑扣蟹养殖、成蟹养殖等不同特色的产业化基地

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逦山东农业大学博士学位论文算公式如下：逡逑ｄ＜ｖ－逡逑ｐ小ｇｋ餐」逡逑＊＊邋ｕ邋）逡逑经过多重检验校正后，选择ＱｖａｌｕｅＳ０．０５的Ｐａｔｈｗａｙ定义为在差异表达基因著富集的Ｐａｔｈｗａｙ。Ｑ－ｖａｌｕｅ和ＦＤＲ类似，都是对ｐ－ｖａｌｕｅ的一种校正。某一个假检验的Ｑ－ｖａｌｕｅ就是ＦＤＲ的最小值，在这些ＦＤＲ下该假设检验可以被认为是显的。逡逑比较转录组分析流程图：逡逑

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