鳗弧菌金属蛋白酶诱导大菱鲆头肾细胞凋亡的作用机制研究

发布时间：2020-07-02 03:22

【摘要】：为了明确鳗弧菌金属蛋白酶对大菱鲆头肾细胞的毒性作用机制,本试验将金属蛋白酶作用于头肾细胞,试验分为对照组(0μg/mL)、低浓度组(1.6μg/mL)、中浓度组(8μg/mL)与高浓度组(40μg/mL)。通过LDH法和MTT法测定细胞膜的完整性和细胞存活率,Hoechst33342荧光染色法检测细胞凋亡形态,采用流式细胞仪检测细胞凋亡、活性氧、线粒体膜电位的变化,并利用RT-qPCR、ELISA法检测凋亡相关基因的表达及酶活变化。试验结果表明,与对照组相比,试验组细胞内LDH释放率随着胁迫时间延长均有上升趋势,且均显著高于对照组(P0.05),以金属蛋白酶高浓度组24h LDH释放率最高,为82.61±9.48%;MTT结果表明低浓度组金属蛋白酶3h对细胞的毒性作用较小,与对照组无显著性差异(P0.05),其他时间点均显著低于对照组(P0.05),24h后细胞存活率为76.19±0.04%,而金属蛋白酶高浓度组在胁迫细胞6h后,细胞存活率在50%以下;Hoechst 33342荧光染色法和Annexin V-FITC/PI双染法结果均显示金属蛋白酶高浓度组在24h细胞凋亡率最高;膜电位结果显示,6～24h金属蛋白酶低浓度组、中浓度组和高浓度组的膜电位均呈现下降趋势,且显著低于对照组(P0.05)。金属蛋白酶高浓度组活性氧24h时细胞的DCF荧光信号最大且显著高于对照组(P0.05)。另外,Caspase 3、Caspase 9与Cyt C基因的表达量呈现先升高后下降的趋势,金属蛋白酶高浓度组Cyt C和Caspase 9基因表达量均在12h时达到最大值,Caspase 3表达量在6h达最高值,且均与对照组具有显著性差异(P0.05),高浓度组Caspase 3的活性在3～24h内呈现上升的趋势,除3h外,其他时间点均显著高于对照组(P0.05)。综上所述,金属蛋白酶对大菱鲆头肾细胞具有细胞毒性作用,高浓度金属蛋白酶可以在短时间内诱导头肾细胞发生凋亡,且具有一定的时间和剂量关系。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S943
【图文】：

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大菱鲜CasPase3基因cDNA全长及其推导的氮基酸序列

【参考文献】

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本文编号：2737671