副溶血性弧菌toxR-S PCR检测方法的建立和华东地区分子流行特征分析

发布时间：2020-07-02 03:47

【摘要】：副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,p),是弧菌科(Vibrio)弧菌属的杆菌或多形态的革兰氏阴性菌,具嗜盐性,广泛存在于海洋以及河口环境,通过食品传播,是遍布世界的食源性致病菌,人多因食用被本菌污染的生的或未煮熟的海鲜而引起急性胃肠炎发生食物中毒。我国每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的报道,且在食源性致病引发的食物中毒病例中占首要位置,快速检测和流行病学调查有助于该病的控制。传统检测方法存在操作繁琐、检测周期长、成本高等问题,促使以检测特异靶基因为目标的分子检测技术快速发展。目前PCR检测方法大多基于毒力基因或看家基因,存在假阳性和漏检的风险,建立敏感而特异的快速分子检测方法迫在眉睫。本文在对toxRS序列进行系统发育及同源性分析的基础上,发现toxR、toxS均有作为种特异性检测靶基因的可能,故分别设计引物primers-R、primers-S及primers-R-S,优化PCR反应条件建立相应PCR方法,通过对57株副溶血性弧菌和19株亲缘相近菌及食源性致病菌的检测,toxR-S PCR显示出较好的稳定性和特异性,检测极限达2pg基因组DNA。toxR-S PCR方法进一步与国标方法对比验证,通过对359份市场海产品检测,符合率高达95.82%,敏感性100%,特异性92.39%。对两种方法检测阳性差异的15份样品,以其总细菌DNA为模板扩增副溶血性弧菌看家基因,测序比对显示与副溶血性弧菌同源性高达97%以上。表明所建立的方法具有快速、特异、敏感等优点,可广泛用于副溶血弧菌的快速检测。现已有对江苏周边、舟山、上海等地区副溶血性弧菌分子流行病学的报道,但缺乏对华东区域整体的调查分析,而华东地区4省1市临海,是副溶血性弧菌污染的"重灾区",加强对该区域毒力相关基因的分子流行病学方面的调查分析,对防控副溶血性弧菌的大流行性爆发有重要意义。本文对华东地区分离到的Vp进行大流行相关毒力基因的检测和多位点序列分型(MLST)。152株分离株共检出4株致病株(tdh+或trh+),其中2株为可能形成大流行的菌株(tdh+和toeRS/new+)。MTase检出率为1.3%,所有分离株不携带完整的Ⅲ型分泌系统,78.3%的分离株携带全套的Ⅵ型分泌系统。152株Vp分为84个STs,其中新的STs有69个。聚类分析表明一部分环境分离株与临床致病株看家基因进化关系相近,同种类宿主分离株的STs更有可能生成聚类关系,此外,归属于同源复合体CC3并非致病株的必要条件。以系统发育分析为基础,对毒力基因分布图及宿主来源进行归类,发现环境分离株分子特征呈多态性。对华东地区副溶血性弧菌的流行病学研究表明,4个致病株和2个可能引起大流行菌株的检出提示副溶血性弧菌具潜在爆发隐患,而分子特征的多态性为疫情的无规律性散发提供条件,华东地区副溶血性弧菌环境分离株对人们的健康有潜在威胁。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S941.4
【图文】：

序列,弧菌,系统发育树,副溶血性弧菌

ｔｏｄ？的系统发育树由２５种（３０株）弧菌构建，ｔｏｘＳ的系统发育树由２６逡逑种Ｇ２株）弧菌构建。系统发育树显示，副溶血性弧菌化ｃｉ？及化ｘＳ均位于单逡逑一进化分支上（图３－１），与其他弧茜进化距离较远，表现出良好的进化差异。逡逑将副溶血性弧菌ｔｏｅ化Ｓ全序列（Ｇｅｎ沈ａｎｋ邋：邋Ｌ１１％NB１）在ＮＣＢＩ邋ＢＬＡＳＴ网站逡逑比对后结果显示，ｔｏｅ／？及ｔｏｃＳ均与副溶血性弧菌高度同源（图３－２），显示出逡逑良好的保守性。系统发育和同源性分析表明，／ｏｘｉ？、／0诚及／0：？：欠－５邋（横跨ｔｏｊｄ？逡逑及ｔｏｃＳ的序列）均有作为种特异性检测靴基因的可能。其中对ｔｏｄ？的分析结逡逑果与先前报道一致，弧菌的ｔｏｄ？序列显示出多样性，可作为副溶血性弧菌种逡逑特异性检测的靴基因Ｐｗｙ。ＭｅｇＡｌｉｇｎ软件比对上述ｔｏｄ？和化诚序列，错定种逡逑内保守而种间特意的区域，针对此Ｈ段靴基因分别设计引物ｐｒｉｍｅｒｓ－民、逡逑ｐｒｉｍｅｒｓ－Ｓ、ｐｒｉｍｅｒｓ－Ｒ－Ｓ邋（表邋３－４）。逡逑逦哩Ｉ＂如ｐａ巧姑ｅｍ扣抑乙ｕｓ逦＜４如２巧！０逦逦、儢＾Ｖｉｂｒｉｏｈｓｗｙｉｓｉｒａｉｎ邋Ｖ旧４加ＥＵ２４ＣＷ３逡逑一＊逦Ｌ邋Ｖ化化ｐｓ巧ｈａｅｍｏＷ；凶Ｓ邋ＡＱ３８１０邋Ａ的２巧的逦巧｜逦＾邋Ｖ化，ｗ邋0化ｎ扣？邋４７村６－！邋ＪＰＲＣＷ００００巧逡逑＾＿？逦！逦Ｖ也如？

亲缘,国标,副溶血性弧菌,海鲜

２．５敏感性试验逡逑Ｐｒｉｍｅｒｓ－Ｒ－Ｓ对阳性参考株基因组ＤＮＡ的浓度梯度ＰＣＲ产物经琼脂糖凝逡逑胶电泳，结果显示（图３－５）当阳性ＤＮＡ为２邋ｐｇ时即能在检测到阳性结果。逡逑表明引物对副溶血性弧菌有较高的敏感性。逡逑２．６重复性试验逡逑Ｐｒｉｍｅｒｓ－Ｒ－Ｓ邋１０次ＰＣＲ扩增试验结果全部为阳性，表明引物的重复性强。逡逑２．７邋ｔｏｃｉ？－ＳＰＣ民与国标方法对海产品的检测结果逡逑来自华东五省沿海城市的３巧份海鲜样品，同时用建立的ＰＣＲ和国标方法逡逑３６逡逑

【参考文献】