鳗弧菌灭活疫苗研制：Ⅰ鳗弧菌O1血清型灭活疫苗中试生产及免疫效力评价Ⅱ鳗弧菌三价灭活疫苗的免疫效果

发布时间：2020-07-03 11:23

【摘要】：鳗弧菌(Vibrio anguillarum),隶属于弧菌科(Vibrionaceae),是常见的水产动物病原菌,可感染多种海水、淡水或半咸水鱼类以及双壳类和甲壳类动物。鳗弧菌感染宿主引起高致死性的出血性败血症,严重危害着全球水产养殖业,造成巨大经济损失。鳗弧菌血清型复杂,目前已知的血清型共23种(O1~O23),其中O1、O2和少部分O3血清型菌株为致病型,其余为环境株。流行病学调查显示,O1、O2、O3血清型致病株均流行于我国海水养殖环境,严重危害着我国大菱鲆(Scophthalmus maximus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)等海水鱼类养殖业发展。随着鱼类免疫学研究的不断深入与疫苗免疫技术的不断发展,鱼用疫苗正逐渐取代抗生素成为水产动物疫病防治的主流手段。1.本实验在实验室摇瓶发酵培养条件下对鳗弧菌VAM003株生长条件进行了初步优化,采用单因素实验法对氯化钠浓度、氮源种类及氮源添加量、碳源种类及碳源添加量进行筛选。实验结果显示,培养基中氯化钠浓度应不低于1%;氮源中胰蛋白胨促生长作用最佳,当添加量为2%时菌产量达峰值;碳源中蔗糖促生长作用最佳,添加量为1.5%时菌产量达到峰值。2.本次实验在5 L发酵罐基础上,以含2.5%氯化钠的TSB培养基为发酵培养基,以鳗弧菌VAM003株为对象,研究了二级种子液培养时间、发酵培养基氯化钠浓度、二级种子液接种量、补料发酵,初步建立了发酵工艺:种子液按10%接种量接种到300 mL氯化钠浓度为2.5%的TSB培养基,28℃,180 r/min恒温振荡培养12~14h得二级种子液;按10%接种量将二级种子液接种到发酵罐,28℃,通气搅拌培养,发酵4 h后开始匀速添加补料葡萄糖,6 h后开始匀速添加补料10倍浓缩的TSB,发酵培养10~12 h后收获菌液。随后在500 L发酵罐进行了放大培养,培养10 h后菌液OD600值达最大值,此时菌液活菌数为12.0×10~9 CFU/mL。3.本实验对大菱鲆鳗弧菌灭活疫苗(VAM003株)中试产品进行了免疫效力评价,检测了疫苗稳定性、保存期、安全性、最小免疫剂量、对不同规格大菱鲆免疫保护效果、对同O1血清型其他菌株及O2、O3血清型菌株的交叉保护作用。实验结果表明疫苗稳定性良好,不同生产批次疫苗免疫后28天RPS均达到100%,单剂量重复注射后也未有不良反应产生,最小免疫剂量为0.025 mL/ind,对体重50 g以上的大菱鲆均有免疫保护作用,疫苗在4℃条件下至少可贮存18个月。4.本课题在鳗弧菌二价(O1/O2)灭活疫苗的基础上以鳗弧菌VAM003(O1)、VAM007(O2)、M2016261(O3)为抗原制备了抗原浓度为10~8 cells/mL及10~9 cells/mL的鳗弧菌三价疫苗,将大菱鲆随机分为2免疫组和1空白对照组,2免疫组以0.1mL/ind腹腔注射免疫大菱鲆即10~7 cells/ind组、10~8 cells/ind组,对照组注射相同剂量灭菌PBS。一次免疫60天后同法对10~8 cells/ind组进行了一次加强免疫,并检测了一次免疫后150天内及同时期二次免疫大菱鲆对三种抗原的血清凝集效价和RPS。实验结果显示,一次免疫3天后可检测到10~7 cells/ind组和10~8 cells/ind组大菱鲆抗鳗弧菌VAM003(O1)、VAM007(O2)、M2016261(O3)抗体,14天后两免疫组(10~7 cells/ind、10~8 cells/ind组)VAM003、VAM007、M2016261抗体效价快速升高,28天后抗体效价均达到峰值1:248.89~1:320,显著高于空白组(P0.05)。28~60天10~7 cells/ind组VAM003、VAM007、M2016261抗体效价保持在1:151.11~1:320,28~150天10~8 cells/ind组VAM003、VAM007、M2016261抗体效价保持在1:106.67~1:320。二次免疫3天后可检测到二免组VAM003、VAM007、M2016261血清抗体效价均高于同期一免组,14天后显著高于同期一免组(P0.05),随后抗体效价均开始下降,60~90天血清效价与同期一免组无显著差异(P0.05)。攻毒实验结果显示,免疫7天后,10~7 cells/ind组和10~8 cells/ind组三种抗原的RPS在5.56~43.75%,14天后10~7 cells/ind组和10~8cells/ind组三种抗原的RPS均快速升高,28天后均达到最大值100%,60天后10~7cells/ind组VAM003下降至71.43%,其余均保持在70%及以上,10~8 cells/ind组RPS均保持在90%以上。120天后10~8 cells/ind组VAM003 RPS开始下降,150天后VAM003RPS下降到35%,VAM003下降到65%,而M2016261还保持在较高水平100%。二次免疫30~60天三种抗原RPS保持在80%以上,均不低于同时期一次免疫组,90天后VAM003 RPS下降到75%,VAM007、M2016261仍保持在80%以上。综上所述,高剂量三价疫苗(10~9 cells/mL)抗体持续期为免疫后28~150天,若取RPS70%为有效免疫保护率,一次免疫后能为大菱鲆提供至少120天的免疫保护期,二次免疫后免疫保护期延长至150天。低剂量疫苗(10~8 cells/mL),抗体持续期及免疫保护期至少为60天。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S948
【图文】：

抗原蛋白,血清型,鳗弧菌

MN MHK6 LSV7 SMW7 SMW5 SMW1 SMQ29 SMQ23（a）M5 VAM003 M1 LSV1 L70 2301 1703 0401

血清型,鳗弧菌,抗原蛋白

图 4-2 鳗弧菌 O2、O3 血清型临床株全菌抗原蛋白检测Fig.4-2 The detection of total bacterial antigen protein in vibrio O2 & O3 serotype.4.3. 小结与讨论鱼用疫苗的研究始于上世纪 40 年代，70 年代首例商品化疫苗诞生。迄今为止，全球已有 140 余种疫苗获得生产许可，美洲、欧洲、东亚等地区已建立工业化疫苗生产基地，在 Alpharma、Aqua Health、Intervet 和 Bayotek 等鱼用疫苗领头企业的带动下，不少国际制药企业纷纷涉足鱼用疫苗领域[2]。我国鱼用疫苗的究起步虽晚，但发展速度较快，近 10 年鱼用疫苗取得了不少研究进展，但很少有疫苗制品进入中试阶段。本次实验参考兽用疫苗临床试验申请要求，对大菱鲆鳗弧菌灭活疫苗（VAM003株）中试产品进行了免疫保护效力评价，从疫苗生产工艺即不同批次疫苗稳定性、疫苗安全性、适宜免疫规格、最小免疫剂量、疫苗保存期及疫苗交叉保护作用对疫苗制品进行了评估。检验结果显示，3 批大菱鲆鳗弧菌灭活疫苗（VAM003 株）中试产品免疫后 28 天 RPS 均达到 100%，表明疫苗生产工艺合理，产品质量稳定，符合批量

【参考文献】