嗜水气单胞菌ahyI基因及其K7乙酰化修饰功能研究

发布时间：2020-07-05 09:26

【摘要】：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种广泛分布在各种水体中的革兰氏阴性菌,也是一种典型的原发性条件致病菌。随着近年来渔业的不断发展,因嗜水气单胞菌感染而引起的鱼类传染病造成了严重的经济损失,为此,对该菌致病机制开展相关研究,有助于防控鱼类病原体并大力发展水产养殖业。群体感应(Quorum sensing,QS)是细菌通过信号分子分泌、识别,从而调控基因水平转移、毒力因子分泌、芽孢产生及生物膜形成等群体行为的一种细胞通讯机制,这些功能对细菌的侵袭、定殖、增殖等致病过程起着重要作用。AhyI(autoinducer synthesis protein,AhyI))是嗜水气单胞菌QS系统LuxI蛋白家族中,能够催化自身产生一种具有诱导功能的分子合成酶;此外,AhyI还可以调控嗜水气单胞菌生物被膜的形成、丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶等的生物活性,由此可以看出,该蛋白在维持细菌基本生理功能中起重要作用。另一方面,蛋白翻译后修饰(protein post-translational modification,PTM)是在蛋白质水平对目的蛋白进行可逆地化学修饰,使蛋白质的结构更为复杂、功能更为完善、调节更为精细、作用更为专一,因此PTM成为当前表观遗传学研究的热点。因此,掌握靶蛋白PTM的相关信息有助于更好地了解疾病状态和其它生命现象。本课题组前期研究发现嗜水气单胞菌AhyI蛋白在K7位点具有乙酰化修饰,但其生物学功能尚不清楚。为了研究AhyI蛋白及其乙酰化修饰对嗜水气单胞菌生理功能的影响,本研究采用同源重组技术,首先构建了?ahyI缺失菌株,再利用基因补回与点突变技术手段,构建ahyI回复株与该基因K7位点突变株模拟K7位点乙酰化修饰,并对ahyI系列菌株的生物学特性进行了分析;同时提取了该菌株的信号分子,进而研究AhyI蛋白的缺失及其乙酰化修饰对群体感应的影响。本论文研究结果如下:1、通过同源重组方法,成功构建了ahyI基因缺失株;根据实验室前期的质谱数据分析,进而构建嗜水气单胞菌ΔahyI的回复株?ahyI::ahyI、空载株?ahyI::Vector以及K7Q、K7R的定点突变株?ahyI::ahyI-K7Q、?ahyI::ahyI-K7R。研究结果发现,AhyI K7Q和K7R位点突变后会降低嗜水气单胞菌蛋白的乙酰化修饰,且K7Q位点突变后对菌株生理功能的影响更显著。2、提取嗜水气单胞菌ATCC7966 ahyI的基因敲除株、回复株、K7Q与K7R点突变株的信号分子,通过薄膜层析色谱(TCL)与E.coli pSB536发光实验研究AhyI对于A.hydrophila信号分子产生的影响。结果发现嗜水气单胞菌K7Q点突变后,其减少AI-1信号分子的分泌,提示AhyI蛋白乙酰化修饰在信号分子产生中具有重要的调节作用。3、通过胞外蛋白酶活分析和溶血性分析等实验发现,?ahyI可在一定程度上影响A.hydrophila毒力因子的分泌。实验结果表明嗜水气单胞菌基因敲除株?ahyI能显著增强细菌溶血能力,并抑制胞外蛋白酶活性;而AhyI蛋K7Q和K7R位点突变与回复株相比无明显变化,说明K7乙酰化修饰对A.hydrophila的两种生理活性无显著影响。4、测定嗜水气单胞菌ahyI的缺失株、回复株和点突变株与野生株的生长曲线与生物膜形成,结果发现野生株与ahyI缺失株、回复株和点突变株相比,它们的生长状况几乎没有差异,其生物膜的形成也不受缺失株影响,说明ahyI基因对嗜水气单胞菌的生长状态没有明显影响。综上所述,通过对嗜水气单胞菌ahyI缺失与系列点突变菌株的生理表型研究,结果发现AhyI蛋白可通过K7位点的乙酰化修饰调控AI-1型信号分子的分泌,但对其它的生理功能没有明显的影响。以上研究结果为深入研究AhyI蛋白翻译后修饰在维持细菌重要生物学功能的作用方面提供了理论依据,进而为系统研究嗜水气单胞菌群体感应调节机制奠定基础。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S941.42
【图文】：

质粒图谱,试剂,江苏大学,硕士学位论文

江苏大学硕士学位论文12图2-1 三种质粒图谱(A) pET-32a 质粒图谱; (B) pRE-112 质粒图谱; (C) pBBR1-MCS1 质粒图谱.Fig.2-1 Three plasmid profiles(B) pET-32a plasmid profile; (B) pRE-112 plasmid profiles; (C) pBBR1-MCS1 plasmidprofiles.2.2 实验试剂与仪器2.2.1 实验试剂凝胶DNA?

区域图,嗜水气单胞菌,片段,PCR扩增

因ahyI 上下游约为500 bp的片段；然后，通过CE Design V1.03软件分别设计上游片段两端引物F1F2、下游片段两端引物F3F4 ，同时分别在F1上游前100 bp与F4下游100 bp设计引物F7F8，如图2-2所示。再通过PCR技术扩增目的基因上游片段与下游片段，扩增产物回收备用。

【参考文献】