淇河鲫组蛋白H2B和HLP1的克

发布时间：2020-07-05 16:43

【摘要】：水产动物疾病防控一直是渔业生产关注的焦点。抗生素是细菌性疾病防控的有效药物,但长时间使用,会使病原体产生耐药性。因此,筛选抗生素替代品,有效控制细菌性疾病是疾病防控的重要内容。抗菌肽是一类具有抗菌活性的阳离子多肽,可有效杀灭细菌,避免产生耐药性,具有替代抗生素的潜在价值。本研究通过克隆淇河鲫(Carassius auratus)组蛋白H2B基因的全长序列,并提取HLP 1对应的编码区N端部分序列,对其分子特征进行分析;采用荧光定量PCR方法,对H2B组织表达及对嗜水气单胞菌的响应进行研究;对HLP 1原核重组表达和人工合成HLP 1的抑菌活性进行研究。基于叉尾洶(Letalurus punetaus)编码区保守序列设计引物。从淇河鲫鳃、肾、脾和肝中提取总RNA,通过RT-PCR技术获得c DNA第一链作为模板,扩增出淇河鲫H2B基因中间片段,将片段连接到p MD 19-T载体,转化至大肠杆菌感受态DH5α中,克隆测序获得H2B中间片段长375 bp。根据已获得H2B中间片段,分别设计一组用于3?UTR和5?UTR扩增的特异性引物,通过巢式PCR方法分别扩增出3?UTR 410 bp和5?UTR 32bp的片段,拼接得到淇河鲫组蛋白H2B基因全长817 bp。ORF Finder预测组蛋白H2B ORF长375 bp,编码134个氨基酸。在线软件预测组蛋白H2B分子量为13.61 k Da,等电点PI值为10.37,带有18个正电荷,为不稳定蛋白质。组蛋白H2B二级结构中含较多α螺旋和无规则卷曲,少量β折叠和延伸链。使用Bio Edit分析包括亲缘关系较远的斑马纹草雀(Taeniopygia guttata)在内的14个物种的H2B编码区序列发现,它们和淇河鲫的同源性都在75%以上,其中与斑马鱼((Danio rerio)同源性更是高达90.7%。HLP 1是组蛋白H2B N末端21个氨基酸组成的多肽,含有丰富的碱性氨基酸。根据组蛋白H2B序列设计特异性引物扩增出HLP 1,并成功构建重组表达质粒PET-32a-HLP 1,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),筛选出阳性菌落加入到含AMP的LB培养基中培养至菌液OD600nm在0.6-0.8之间,经IPTG诱导培养后沉淀、洗涤、裂解菌体,收集裂解液,然后通过SDS-PAGE凝胶电泳,成功检测出融合蛋白。采用RT-q PCR方法检测了淇河鲫组蛋白H2B及HLP 1基因在鳃、肾脏、脾脏、肝脏和头肾中的表达,正常情况下组蛋白H2B m RNA在肝脏中表达量最高,肾脏和头肾次之,在鳃和脾脏中表达量较少,HLP1在头肾中表达量最高,肝脏次之,其余组织中的表达水平和H2B相似。鱼体注射嗜水气单胞菌后48 h内,H2B和HLP 1 m RNA表达量在各组织中明显上调。人工合成淇河鲫多肽HLP 1,将HLP 1以2倍浓度梯度稀释为200μg/m L、100μg/m L、50μg/m L和25μg/m L,随着HLP 1浓度的升高,抑菌圈直径逐渐扩大,且25 ug/ml HLP 1即能达到100mg/m L氨苄的抗菌水平,说明HLP 1抗菌活性很高,其在水生动物特别是鱼类抗病和免疫中能起到重要作用。
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【图文】：

淇河,琼脂糖凝胶,质量浓度,琼脂糖凝胶电泳

、肾、脾中提取总 RNA，使用 1.5%琼脂糖凝胶s 比较亮，5 s 比较弱（图 2-1），说明 RNA 提取果显示鳃、肾、脾的质量浓度分别为 1021 ng/μL/280nm都在 1.8-2.0 之间。

组蛋白

组蛋白H2B的5RACE克隆和3RACE克隆

【参考文献】