尼罗罗非鱼补体C9和穿孔素基因的克隆及其与链球菌病抗性相关SNP标记的筛选

发布时间：2020-07-07 01:26

【摘要】：罗非鱼是我国淡水鱼类优势养殖品种。但在养殖过程中,链球菌病频发严重制约了我国罗非鱼产业的可持续发展。目前对该病尚未有效防治方法,所以从种质上入手,进行抗链球菌病的定向选育,培育抗链球菌病罗非鱼新品种(系),是值得期待的措施。本研究拟从克隆获得尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫相关基因补体C9(OnC9)和穿孔素基因(OnPFP)入手,对其进行结构和组织表达分析,初步了解其生物学功能,并分析其单核苷酸多态性,进行不同基因型或单倍型与尼罗罗非鱼链球菌病抗性的关联分析,以期筛选出有育种指导价值的优势基因型。取得的结果如下:1尼罗罗非鱼OnC9和OnPFP的克隆和表达分析以尼罗罗非鱼OnC9和OnPFP的预测序列为模板设计引物,获得基因的中间片段序列。采用RACE方法获得了OnC9和OnPFP的cDNA序列全长。完整OnC9 cDNA序列长度为2502bp,ORF为1761bp,编码586个氨基酸。分析发现OnC9氨基酸存在保守结构域:TSP1、LDLRA、MACPF、EGF-Lik。氨基酸序列同源性分析表明,OnC9与牙鲆C9氨基酸同源性最高,达73.0%,与其他鱼类C9的同源性介于49.3-71.4%之间。本文的研究表明OnPFP存在两个完整cDNA:OnPFP1和OnPFP2。OnPFP1完整cDNA序列长度为2461bp,ORF为1764bp,编码587个氨基酸。分析发现OnPFP1氨基酸的保守结构域为MACPF和C2。OnPFP2完整cDNA序列长度为2442bp,ORF为1266bp,编码421个氨基酸。OnPFP2仅存在C2结构域。NJ系统进化树显示,OnPFP1和OnPFP2氨基酸序列同源性为78.5%,OnPFP1与其他鱼类的氨基酸序列同源性为38.2-75.0%,OnPFP2与其他鱼类的氨基酸序列同源性为36.5-78.2%。荧光定量PCR(q PCR)检测结果表明,OnC9基因在所检测组织器官中表达水平有明显差异。在肝脏中表达量最高,其次是在肠道、后肾、鳃和皮肤,在肌肉中表达量比较低,在脑、脾脏、心脏、头肾和胸腺中表达量最低。无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染尼罗罗非鱼168h内,肝脏、肠道、后肾、皮肤、肌肉、鳃中的OnC9表达量均表现为在感染后12h、48h(或36h)、120h先后出现三个峰值的波动式表达的规律。OnPFP1和OnPFP2在脑、后肾、脾脏、心脏、肝脏、鳃、肌肉、头肾、皮肤、胸腺、肠道、血液中均有表达,它们在不同组织中表达量不同,OnPFP1在脾脏和鳃中表达量较高,OnPFP2在脾脏和头肾中表达量较高。无乳链球菌感染尼罗罗非鱼216h内,OnPFP1在肝脏、脾脏、鳃、后肾、头肾、胸腺中表达量均表现为先上升,再下降,然后再上升再下降的趋势。OnPFP2在肝脏、脾脏、鳃、后肾中表达量逐渐上升,在胸腺中的表达量先上升后下降。2尼罗罗非鱼补体C9和穿孔素基因单核苷酸多态性位点(SNP)位点的筛选及其与链球菌病抗性的关联分析首先克隆得到OnC9和OnPFP基因组序列,对两个基因进行单核苷酸多态性分析,获得了SNP位点。然后采用人工感染无乳链球菌的方法,建立尼罗罗非鱼易感群体(81尾)和抗病群体(84尾),通过Snapshot法获得SNP位点,并研究这些多态性位点与链球菌病抗性之间的的相关性。通过PCR得到OnC9和OnPFP基因组DNA全长,获得OnC9基因组DNA全长6883bp,包含11个外显子和10个内含子。OnPFP1基因组DNA全长6849bp,包含6个外显子和5个内含子,OnPFP2基因组DNA全长3812bp,包含3个外显子和2个内含子。在OnC9基因中获得了22个潜在的SNPs位点,其中19个在内含子中,3个在外显子中,2个非同义突变,1个同义突变。对22个位点在易感群体和抗病群体中进行了基因型频率和等位基因频率检测,其中发现C-2660T和T-5790A位点的基因型分布频率在抗病和易感群体中存在显著性差异(P0.05)。连锁不平衡分析表明,多个位点之间处于高度连锁状态(r20.80)。单倍型分析显示,共发现了12个单倍型,其中单倍型GTTAG和ATGA与链球菌病易感性显著相关(P0.05)。在OnPFP1基因中获得16个潜在的SNPs位点,其中13个在内含子中,3个在外显子中,1个在3’侧翼区,2个在外显子中,均为非同义突变。对16个位点在易感群体和抗病群体中进行了基因型频率和等位基因频率检测,其中发现T-499G和A-2684G位点基因型分布频率在抗病和易感群体中存在显著性差异(P0.05)。连锁不平衡分析表明,G-2019C和A-3827C、A2154G处于高度连锁状态(r2=0.813,r2=0.955)。单倍型分析显示,共发现了3个单倍型,没有发现与链球菌病显著相关的单倍型。在OnPFP2基因中获得5个潜在的SNPs位点,2个在内含子中,1个在3’侧翼区,2个在外显子中,均为非同义突变。对5个位点在易感群体和抗病群体中进行了基因型频率和等位基因频率检测,没有发现在抗病和易感群体中存在显著性差异的位点。连锁不平衡分析表明,其中C-690T与C-618T处于高度连锁状态(r2=0.83)。单倍型分析显示,共发现了3个单倍型,没有发现与链球菌病显著相关的单倍型。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S943
【图文】：

氨基酸序列,两栖类,末端序列,哺乳动物

存在一个 TSP1 结构域，鱼类和两栖类的补体 C9 氨基酸序列在 C 端和 N 端各存在一个 TSP1 结构域，哺乳动物 C 端不存在 TSP1 结构域(图 1-3)。家兔 Oryctolagus cuniculus (NP_001075815)人 Homo sapiens (NP_001728)牛 Bos Taurus (NP_001030441)小鼠 Mus musculus (NP_038513)爪蟾 Xenopus laevis (NP_001079814)草鱼 Ctenopharyngodon idella (ABN49522)香鱼 Plecoglossus altivelis (CBX31962)虹鳟 Oncorhynchus mykiss (CAJ01692)底溕 Fundulus heteroclitus (AAR87007)尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus红鳍东方渶 Fugu rubripes (AAC60288)牙鲆 Paralichthys olivaceus (BAA86878)999110010099859899780.05图 1-2 尼罗罗非鱼 C9 基因和其它动物的 NJ 分子进化树Fig. 1-2 NJ-phylogenetic tree of C9 genes constructed by using amino acid sequences

尼罗罗非鱼,基因,头肾,后肾

上海海洋大学硕士学位论文2.3 OnC9 基因在健康尼罗罗非鱼不同组织中的表达分析qPCR 检测结果表明，OnC9 基因在所检测的 12 个组织器官(脑、后肾、脾脏、心脏、肝脏、鳃、肌肉、头肾、皮肤、胸腺、肠道、血液)中表达水平有明显差异。OnC9 在肝脏中表达量最高，其次是肠道、后肾、鳃、皮肤，在肌肉中表达量比较低，脑、脾脏、心脏、头肾和胸腺中表达量最低(图 1-4)。

序列,尼罗罗非鱼,无乳链球菌,感染后

图 1-5 无乳链球菌感染后尼罗罗非鱼补体 C9 基因在尼罗罗非鱼中各组织的表达情况注：相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示显著性差异(P<0.05)Fig . 1-5 Quantitative expression profile of Oreochromis niloticus C9 gene after the challenge withStreptococcus agalactiaeNote: Same letters indicate no significant differences (P > 0.05), Statistical significance isrepresented by different letters (P< 0.05)3 讨论研究表明，MAC 和穿孔素(MACPF)超家族是具有成孔功能的家族之一。其中，补体 C6、C7、C8、C9 因其在杀伤途径中的重要作用，被统称为末端补体成分(Terminal complement components，TCCs)。TCCs 中的补体 C6，C7，C8α，C8β和C9 是一组大小和复杂程度不同的结构相关血浆蛋白，序列具有高度的相似性，属于同一基因家族。TCCs 和穿孔素一样，存在一些相同的保守结构域，如 TSP1、LDLRA、MACPF 和 EGF-Like[11, 42, 43]。本研究采用 RACE 技术首次克隆了尼罗罗非鱼补体 C9 基因(OnC9)的全长 cDNA 序列，共 2492bp，开放阅读框为 1761bp，编码 586 个氨基酸。其中，OnC9 预测序列长 2372bp，5’UTR 长 34bp，3’UTR 长577bp。本研究克隆得到的 5’UTR 和 3’UTR 序列比预测序列更长更完整。相似性

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