团头鲂甘露糖受体CTLD4-8结构域抗体制备及功能分析

发布时间：2020-07-08 06:13

【摘要】：甘露糖受体(MR,CD206)是甘露糖受体家族中最先发现的成员,它能够识别多种内源性和外源性甘露糖化配体,在宿主免疫和内环境稳态中发挥着重要作用。MR胞外有8个C-型凝集素样结构域(CTLDs),CTLD4-8结构域有同等于完整的MR结合天然糖蛋白配体能力,能介导巨噬细胞对多种病原微生物的识别和吞噬。MR表达并不局限于巨噬细胞,在其他细胞如肾小球系膜细胞、淋巴和肝内皮细胞、视网膜色素上皮细胞、成肌细胞以及脑中的小胶质细胞等都发现有MR表达。相对于哺乳动物MR的结构、功能以及分布已有的详尽研究,有关鱼类MR的报道却很少,尤其是MR蛋白的分布,迄今还没有过报道。本研究从MR的CTLD4-8结构域表达载体的构建、原核表达、蛋白纯化等方面入手,进而制备了抗团头鲂MR的多克隆抗体(Ma MR-CTLD4-8)。结合免疫组化技术系统研究了MR蛋白在团头鲂胚胎期以及幼鱼期各组织的分布,并研究了MR与GFP-E.coli的相互作用,探讨其在团头鲂巨噬细胞吞噬病原微生物过程中发挥的作用,以及引起的免疫应答。主要研究结果如下:(1)在优化条件下,高效表达CTLD4-8重组蛋白。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,证明成功表达了分子量大小为110 k Da的融合蛋白;(2)纯化目的蛋白免疫日本大耳白兔三次,制备了多克隆抗体。ELISA检测抗血清效价在51,200左右。以提取的团头鲂组织总蛋白作为蛋白样品,经Western-blot分析,在PVDF膜上检测出单一条带,分子量在170~180 k Da,与预测的MR大小相符。说明制备的多克隆抗体具有特异性,可用于下面的研究;(3)利用免疫组化技术研究了MR蛋白在团头鲂胚胎期及幼鱼各组织中的分布。结果表明MR首先出现在受精卵期的卵黄囊处,在出膜期分布广泛。MR蛋白分布与早期巨噬细胞时空分布有一定关联性,预测早期巨噬细胞就开始表达MR,而不是局限于终端分化巨噬细胞。MR广泛表达于团头鲂头肾、体肾、肝、脑、肠、鳃、肌肉和心脏等组织,而在脾中的表达很少,但是嗜水气单胞菌感染后,MR在脾中的表达变得非常丰富,头肾中也是如此;(4)间接免疫荧光分析显示MR在巨噬细胞的膜上及胞质内都有表达;(5)MR介导巨噬细胞对表达绿色荧光蛋白大肠杆菌的非特异性识别和吞噬,并参与多种炎性介质的分泌和表达,包括活性氧、NO以及炎性细胞因子IL-1β和TNF-α。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S941
【图文】：

甘露糖受体,家族,受体,纤维连接蛋白

图 1.1 甘露糖受体家族和鸡卵黄囊 IgY 受体（FcRY）（Llorca 2008）ig. 1.1 Mannose receptor family and chicken yolk sac IgY receptor (FcRY) (Llorca 家族四个成员具有相似的整体结构，由 N 端依次为：富含半胱氨酸ne-rich domain, CR），Ⅱ型纤维连接蛋白结构域（fibronectin type Ⅱ

构象,甘露糖受体,家族,结合位点

1.2 甘露糖受体家族伸展构象和压缩构象之间的转变（Llorca odel for the conformational transitions between an extended and aof the mannose receptor family (Llorca 2008)虽然结构相似，但是在功能或分布上却存在差异。研究CTLDs 结构域都没有糖结合能力（Mullin et al 1997）细胞（dendritic cell, DC），发挥抗原递呈作用，而 PLEndo180 和 MR 虽然具有相似的配体结合成分，都能白，但结合位点不一样，Endo180 的糖结合位点在 C糖结合位点位于 CTLD4 和 CTLD5（张小磊和赵鲁杭。表达细胞的类型也有差别，Endo180 主要由基质成细胞表达，而 MR 主要表达于巨噬细胞、上皮细胞和团头鲂 MR 展开了分布和功能研究，以下是对 MR 最述如下：

分子,PCR扩增产物

CTLD4-8片段的PCR扩增产物Fig.2.1ThePCRproductofCTLD4-8

【参考文献】