盐酸氯苯胍在异育银鲫体内的药代动力学及其对异育银鲫免疫功能影响的研究

发布时间：2020-07-08 09:30

【摘要】：盐酸氯苯胍是一种人工合成的抗球虫药,其作用机理主要是通过影响球虫蛋白质的生物学过程来抑制球虫。我国于2010年将此药规定为治疗鱼类粘孢子虫病的国标渔药,但是目前鱼类在该药使用之后产生的反应尚不明确。同时,在该药的使用过程中,对养殖鱼类的其他疾病是否有影响也未知。本课题在以异育银鲫为实验对象的基础上,不仅研究了盐酸氯苯胍在其体内的药代动力学,还研究了盐酸氯苯胍对异育银鲫免疫功能的影响,以及对异育银鲫病毒病和细菌病的影响。1.盐酸氯苯胍在异育银鲫体内的药代动力学研究在水温为(25±1)℃时,对体质量为(120±10)g的异育银鲫分别口灌剂量为20mg/kg、30mg/kg和40mg/kg的盐酸氯苯胍,分12个时间点取异育银鲫血液、肌肉、肾脏、肝脏四种组织,并用高效液相色谱法测定盐酸氯苯胍在其体内的药代动力学。结果显示,三种剂量的盐酸氯苯胍在异育银鲫各组织中药时曲线均呈“双峰”现象。20mg/kg、30mg/kg和40mg/kg的药物在该鱼血液中的达峰时间分别为:Tmax=2.3h、Tmax=2.1h和Tmax=2.2h;血药质量浓度峰值分别为Cmax=0.55μg/mL、Cmax=0.73μg/mL和Cmax=1.17μg/mL;药时曲线下面积分别为:AUC=9.35μg/(mL·h)、AUC=13.02μg/(mL·h)和AUC=13.98μg/(mL·h)。同时,异育银鲫各组织中盐酸氯苯胍的药时曲线下面积由大到小依次是肾脏、肝脏、血液、肌肉。清除速率显示,盐酸氯苯胍在肌肉中清除最慢,其次是血液。ROBH在肾脏和肝脏中具有一定蓄积作用,主要表现在药物含量高、MRT值偏大。本实验条件下,盐酸氯苯胍在异育银鲫体内的休药期建议不低于9 d。但考虑到实际养殖情况和天气原因,临床休药期可根据实际情况适当延长。2.盐酸氯苯胍对异育银鲫的保护性研究在水温为(25±1)℃时,以口灌给药的方式,对体质量为(120±10)g的异育银鲫口灌20mg/kg剂量的盐酸氯苯胍,24h后进行腹腔注射浓度分别为10~5、10~6、10~7、10~8、10~9CFU/mL的嗜水气单胞菌AH10 200μL,观察96h内异育银鲫的死亡情况。通过Bliss法计算得出嗜水气单胞菌AH10对异育银鲫96h的半致死浓度(LD_(50))为6.98×10~7 CFU/mL,而通过相同浓度的嗜水气单胞菌AH10腹腔注射异育银鲫,96hLD_(50)为9.49×10~6 CFU/mL。同时,在相同环境下,对异育银鲫分别口灌40mg/kg、20mg/kg和0mg/kg剂量的盐酸氯苯胍,24h后腹腔注射II型鲤疱疹病毒(CyHV-2)200μL,观察7天内异育银鲫的死亡率。结果显示,攻毒CyHV-2后的异育银鲫在3天后开始死亡,第四天死亡数达到高峰,并在第6天全部死亡,而对照组无死亡现象。由此可知,盐酸氯苯胍对细菌病引起的异育银鲫的死亡率有一定的控制作用,而对病毒病引起的异育银鲫的死亡率没有抑制效果。因此,建议在养殖鱼类疾病爆发的前期,适当使用盐酸氯苯胍在防治粘孢子虫病的同时,还可防止因细菌病爆发造成的鲫死亡率。3.盐酸氯苯胍对异育银鲫免疫功能影响的研究盐酸氯苯胍是治疗鱼类粘孢子虫的药物之一,但是该药对鱼类免疫功能的影响尚无任何报道。以盐酸氯苯胍在异育银鲫体内药代动力学的研究为基础,用异育银鲫血液中最高浓度1.17μg/mL的盐酸氯苯胍处理异育银鲫鳍条细胞后于24h和48h取细胞样品进行转录组测序。对测序数据进行组装之后,在转录组序列长度为201bp到13990bp的范围内,总共得到了118364个功能基因。其中,24h产生1976个差异表达基因调,包括1271个上调基因和705个下调基因;48h产生2568个差异表达基因,包括2071个上调基因和497个下调基因;而24h和48h有336个共同差异基因。KEGG富集分析后,得到了超过20免疫相关的信号通路。在其中挑选了3条(P0.05),分别是JAK-STAT signaling pathway,Natural killer cell mediated cytotoxicity和Th1 and Th2 cell differentiation。通过进一步的KEGG分析(P0.01),在这3条信号通路上挑选了9个免疫相关的基因进行荧光定量PCR验证。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S948
【图文】：

工作曲线,氯苯胍,盐酸,工作曲线

盐酸氯苯胍标准工作曲线回归方程为：y=179.35x -3.9238（R2=0.997），在 0.05-1μg/mL 的范围内，ROBH 的峰面积与其质量浓度呈较好的线性关系（图 1-1）。以2 倍基线噪音的药量为最低检测限，得知在检测环境下，ROBH 的最低检测限为20ng/mL。

氯苯胍,异育银鲫,盐酸,剂量

图 1-2 不同盐酸氯苯胍口灌剂量在异育银鲫各组织内的药-时曲线Fig.1-2 ROBH concentration-time curves in different tissues of crucian carp atdifferent oral administration dose

氯苯胍,异育银鲫,盐酸,总数

表 2-3 口灌不同剂量的盐酸氯苯胍后感染 CyHV-2 异育银鲫的死亡数ble2-3 The results of silver crucian carp on CyHV-2 infected following different doses ROoral administration剂量mg/kg)各组鱼总数（尾）7 天内鱼死亡情况 7 天内累计死亡总数1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d对照组 10 0 0 0 0 0 0 0 00 10 0 0 1 4 5 0 0 1020 10 0 0 1 5 4 0 0 1040 10 1 1 0 2 3 3 0 10

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