罗氏沼虾对氨氮的胁迫响应及其不同养殖模式的环境效应

发布时间：2020-07-09 09:56

【摘要】：罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)是我国主要的养殖品种之一,目前养殖模式单一,养殖中后期常面临氨氮浓度升高、水质恶化等问题,而且富含氨氮的养殖尾水排放会导致周围水体、土壤环境遭受污染。基于上述考虑,本文研究了氨氮对罗氏沼虾的急性和慢性毒性作用,首次采用代谢组学方法分析了罗氏沼虾对氨氮的代谢、解毒机制,通过围隔实验研究了不同罗氏沼虾养殖模式的环境效应。1、氨氮短期胁迫对罗氏沼虾抗氧化酶、热休克蛋白和细胞凋亡相关基因表达的影响采用生物毒性实验方法研究了氨氮对体重为3.46±0.66 g罗氏沼虾的急性毒性作用。设置非离子氨浓度0、0.5、1.88 mg·L~(-1),研究了氨氮胁迫4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h对罗氏沼虾血淋巴、肌肉、鳃超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,以及肌肉谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响,并检测了氨氮对其肌肉和肝胰腺抗氧化酶基因(SOD、CAT和GPX)、热休克蛋白基因(HSP60、HSP70和HSP90)、细胞凋亡基因(Caspase 2、Caspase 3和Bcl-2)表达的影响。结果表明:(1)非离子氨对罗氏沼虾24 h、48 h、72 h和96 h的半致死浓度(LC50)分别为7.72、5.44、4.28和3.78 mg·L~(-1),其安全浓度为0.378 mg·L~(-1)。(2)1.88 mg·L~(-1)组在8 h时显著诱导了鳃T-SOD活性,72 h时显著诱导了鳃CAT活性;0.5、1.88 mg·L~(-1)组24 h时显著诱导了血淋巴CAT活性,1.88 mg·L~(-1)组24 h时亦同时显著诱导了血淋巴T-SOD活性;72 h时,0.5、1.88 mg·L~(-1)组显著诱导了肌肉GSH-Px活性。72 h时,1.88 mg·L~(-1)组罗氏沼虾血淋巴、肌肉和鳃MDA含量均显著高于对照组和0.5 mg·L~(-1)组。(3)1.88 mg·L~(-1)组肌肉SOD基因表达分别在8 h和24 h时被显著诱导,该组肝胰腺SOD基因也在8 h和48 h时被显著诱导;1.88 mg·L~(-1)组肌肉和肝胰腺CAT基因分别在3 h和8 h时被显著诱导到最高值;1.88 mg·L~(-1)组肌肉和肝胰腺GPX基因均在8 h时被显著诱导到最高值,其中肝胰腺GPX基因表达分别是对照组和低浓度组的23.86倍和12.21倍。(4)0.5 mg·L~(-1)组在3 h时显著诱导了肌肉HSP60基因表达,1.88 mg·L~(-1)组在8 h、24 h和72 h时均显著诱导了肌肉和肝胰腺HSP60基因表达;1.88 mg·L~(-1)组在8 h、24 h和48 h时显著诱导了肝胰腺HSP70基因表达,该浓度下肌肉HSP70基因表达仅在8 h时被诱导,0.5 mg·L~(-1)组肝胰腺HSP70基因表达在8 h时被诱导;1.88 mg·L~(-1)组分别在8 h、12 h和24 h时显著诱导了肌肉HSP90基因表达,在3h和72 h时诱导了肝胰腺HSP90基因表达,0.5 mg·L~(-1)组在12 h时诱导了肌肉HSP90基因表达,在72 h时显著诱导肝胰腺HSP90基因表达。(5)1.88 mg·L~(-1)组肌肉和肝胰腺Caspase 2基因表达分别在3 h和8 h时被显著诱导至最大值;1.88 mg·L~(-1)组肌肉Caspase 3基因表达在24 h和48 h时被显著诱导,肝胰腺Caspase 3基因表达在8h和24 h时亦被显著诱导;氨氮对肝胰腺Bcl-2基因表达无显著影响,0.5 mg·L~(-1)组肌肉Bcl-2基因表达在3 h时被显著诱导。氨氮胁迫72 h后,1.88 mg·L~(-1)组罗氏沼虾肝胰腺出现明显细胞凋亡现象。2、氨氮短期胁迫与恢复对罗氏沼虾抗氧化酶、热休克蛋白和细胞凋亡相关基因表达的影响在温度(25±1)℃、pH 8.0±0.5条件下采用生物毒性实验方法研究了氨氮对罗氏沼虾幼虾(0.16±0.06 g)的LC50。设置0、0.43、0.64、0.85、1.06 mg·L~(-1)等5个非离子氨浓度,研究了氨氮胁迫48 h及恢复48 h对罗氏沼虾SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量的影响,并检测了胁迫和恢复对其肌肉抗氧化酶基因(SOD、CAT和GPX)、热休克蛋白基因(HSP60、HSP70和HSP90)、细胞凋亡基因(Caspase2、Caspase 3和Bcl-2)表达的影响。(1)非离子氨对罗氏沼虾24 h、48 h、72 h、96 h的LC50分别为4.25、2.35、1.86、1.54 mg·L~(-1),安全浓度为0.154 mg·L~(-1)。(2)氨氮胁迫48 h时,各试验组罗氏沼虾SOD活性显著升高(P0.05),而CAT和GSH-Px活性变化不显著(P0.05);与对照组相比,0.43、0.64和1.06 mg·L~(-1)组MDA含量显著升高(P0.05)。与胁迫48h时相比,恢复48 h后各组SOD活性均显著下降(P0.05);除0.85 mg·L~(-1)组外,其余试验组SOD活性仍然显著高于对照(P0.05);0.85、1.06 mg·L~(-1)组CAT活性较胁迫状态显著下降(P0.05);试验组与对照组MDA含量无显著差异。(3)氨氮胁迫48 h时,1.06 mg·L~(-1)组CAT基因表达显著高于其余各组(P0.05),恢复48 h后各浓度组间无显著差异。氨氮胁迫48 h对SOD基因表达无显著影响,恢复48 h后0.43、1.06 mg·L~(-1)组SOD基因表达显著高于其他组。氨氮胁迫48 h时,0.85 mg·L~(-1)组GPX基因表达显著大于对照组(P0.05),恢复48h后GPX基因表达与对照组相比无显著差异(P0.05)。(4)氨氮胁迫和恢复对HSP70基因表达均无显著影响。胁迫48 h时,各试验组HSP90表达均显著上升,恢复48 h后各组HSP90基因表达较胁迫时下降,且显著低于对照组(P0.05)。胁迫48h时,除0.43 mg·L~(-1)组外的其余试验组HSP60基因表达显著上升,恢复48h后表达量下降至与对照组无显著差异。(5)氨氮胁迫48 h时,各试验组Caspase2、Caspase3表达皆显著高于对照组;恢复48 h后,除0.43 mg·L~(-1)组外其余试验组Caspase2基因表达与对照组相比无显著差异,各试验组Caspase3基因表达与对照组相比差异均不显著。3、氨氮长期胁迫对罗氏沼虾生长、代谢酶、抗氧化酶、代谢组的影响将罗氏沼虾(0.28±0.05 g)暴露于非离子氨浓度为0、0.108、0.216、0.324和0.54 mg·L~(-1)中20d,研究氨氮对罗氏沼虾生长、成活率、代谢酶活性的影响,同时检测了0.108、0.324和0.54 mg·L~(-1)氨氮对其肌肉代谢组的影响。结果表明:(1)0.54 mg·L~(-1)组罗氏沼虾成活率显著降低,该组增重率也降低但差异不显著。(2)0.216、0.324和0.54 mg·L~(-1)组罗氏沼虾肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脱氢酶(GDH)活性显著降低,0.216 mg·L~(-1)组的碱性磷酸酶(AKP)活性也显著降低。随氨氮浓度升高,肝胰腺和肌肉谷草转氨酶(GOT)活性逐渐升高但差异不显著,对谷丙转氨酶(GPT)活性的影响也同样不显著。0.216mg·L~(-1)组罗氏沼虾肝胰腺尿素氮含量显著高于对照组和0.54 mg·L~(-1)浓度组。(3)氨氮对肌肉CAT活性无显著影响;0.324 mg·L~(-1)组SOD活性最大,显著大于对照组和0.108 mg·L~(-1)组;0.216 mg·L~(-1)组MDA含量最低,显著低于0.108mg·L~(-1)组,其余各组差异不显著。(4)氨氮对罗氏沼虾肌肉嘌呤代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢途径、а-亚麻酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢和膦酸盐与磷酸酯代谢、萜类生物合成、赖氨酸降解以及赖氨酸生物合成途径具有明显的影响。上述研究可见,高浓度氨氮对罗氏沼虾产生了胁迫效应,显著影响其成活和生长。为探寻减少罗氏沼虾养殖过程中氨氮积累的方法,本文采用围隔实验研究了罗氏沼虾不同养殖模式的环境效应。实验设置6种养殖模式:罗氏沼虾单养(MP组)、罗氏沼虾+浮萍(Lemna minor)(PP组)、罗氏沼虾+鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)(PF组)、罗氏沼虾+背角无齿蚌(Anodonta woodiana)+鲢鱼(PMF组)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+浮萍(PMP组)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+浮萍+鲢鱼(PMPF组),养殖64 d。评估了不同养殖模式对罗氏沼虾生长、水质以及肠道菌群的影响。4、养殖模式对罗氏沼虾生长和水质指标的影响养殖过程中,每10 d测定一次水质理化指标(浊度、DO、pH、Chl-a、COD、BOD、NO_3-N、NO_2-N、NH_3-N、TN、TP、PO_4-P、TOC)。养殖结束(64 d)时测定增重率和成活率。结果表明,PMPF组增重率最大,但与其它组无显著差异,各组间成活率也无显著差异。PMPF组中平均DO最高,而PF组中TN和Chl-a浓度最高。与MP组相比,混养鲢鱼的PF、PMF和PMPF组有效降低了PO_4-P含量。浮萍可有效吸收水中的N和P,有浮萍的PP和PMP组中Chl-a浓度较PF组显著下降。PMPF养殖模式具有较好的生态效益和经济效益。5、不同养殖模式罗氏沼虾肠道菌群结构及与水环境因子的关系通过高通量测序技术分析养殖模式对罗氏沼虾肠道菌群结构的影响,冗余分析(RDA)肠道菌群与水环境因子的关系。结果表明:肠道细菌多样性指数MP组最大(4.08),PMF组(1.27)最低。变形菌门(Proteobacteria)、软壁菌门(Tenericute)、厚壁菌门(Firmicutes)在虾肠道中相对丰度较大。不同模式最大优势菌存在较大差异,其中MP、PMP和PMPF组为气单胞菌属(Aeromonas),PP组为柠檬酸杆菌属(Citrobacter),PF和PMF组为Candidatus Hepatoplasma。肠道细菌与环境因子相关分析表明:TP对罗氏沼虾肠道菌群具有显著影响(P0.05)。肠棕气单胞菌(Aeromonas enteropelogenes)、有益菌肠球菌(Enterococcus)、格氏乳酸菌(Lactococcus garvieae)与NO_3-N、TN正相关,红细菌属(Rhodobacter)、假单胞菌(Pseudomonas vranovensis)与TP正相关。可见,养殖模式可通过影响水体营养盐尤其是氮磷含量影响罗氏沼虾肠道微生物群落结构。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4
【图文】：

罗氏沼虾,凋亡,氨氮,肝胰腺

上海海洋大学博士学位论文2.2.7 氨氮对罗氏沼虾肝胰腺细胞凋亡的影响氨氮对罗氏沼虾肝胰腺细胞凋亡影响如图 2-7 所示。图中凋亡细胞被染成色，正常细胞为蓝紫色。对照组未见有凋亡细胞（图 2-7A），低浓度组（0.05mg·L-1）肝胰腺组织有少量细胞发生凋亡（图 2-7B），而高浓度组（1.88 mg·L肝胰腺组织有较多细胞发生凋亡（图 2-7C）。

主成分分析,样本,主成分

图4-6 QC样本TIC重叠图Fig. 4-6 The overlay chart of TIC spectra of QC sample4.2.5.2 QC样本主成分分析质控样本QC可以相对聚集在一起，聚集得越好表明仪器越稳定，采集的数据质量越好。X轴表示第一个主成分，Y轴表示第二个主成分。括号里的数字表示该主成分能综合原始信息的比例。由图4-7可知，本实验质控样本QC较好聚集在一起，说明该分析过程具有较好的重复性和稳定性。

样本,主成分

图4-6 QC样本TIC重叠图Fig. 4-6 The overlay chart of TIC spectra of QC sample4.2.5.2 QC样本主成分分析质控样本QC可以相对聚集在一起，聚集得越好表明仪器越稳定，采集的质量越好。X轴表示第一个主成分，Y轴表示第二个主成分。括号里的数字表该主成分能综合原始信息的比例。由图4-7可知，本实验质控样本QC较好聚集一起，说明该分析过程具有较好的重复性和稳定性。

【参考文献】